La première étape de la compréhension des modes de liaison d’une kinase est l'élucidation de sa structure, qui peut être obtenu expérimentalement soit par cristallographie aux rayons X ou par RMN, soit par des méthodes in silico.
Les structures tridimensionnelles (3D) des protéines sont d'un grand intérêt pour la conception rationnelle de nombreux types d'expériences biologiques. La connaissance de la structure tridimensionnelle d'une protéine ouvre la possibilité de déterminer sa fonction. Nous rapportons dans ce chapitre les étapes de construction d’un modèle du domaine catalytique de la tyrosine kinase LMTK3 dans l’une de ces deux conformations (DYG-in). Les résultats de ce travail ont été publiés en Mai 2017 au Journal of Biomelecular Research and Therapeutics sous le titre: «Three-dimensional Structure Prediction of the Human LMTK3 Catalytic
Domain in DYG-in Conformation».
I. Prédiction de la structure 3D de LMTK3
Construire un modèle d'homologie nécessite l’: 1- Identification de la structure du modèle ;2- Alignement de la séquence cible et de la structure du modèle ; 3- Evaluation de la qualité du modèle.
Ces étapes peuvent être répétées jusqu'à l’obtention d’un résultat de modélisation satisfaisant. Chacune de ces étapes nécessite un logiciel spécialisé et l'accès à une base de données de séquences et de structures de protéines.
I.1. Extraction de la séquence et sélection du modèle
Lémur tyrosine kinase (LMTK3) est le dernier membre de la famille LMTK, il est situé à 19q13.33 sur le chromosome 19, comme illustré dans la figure 27. La séquence de la protéine LMTK3 a été obtenue à partir de la base de données UniProt (www.uniprot.org). (ID: Q96Q04). Elle a 1460 acides aminés. Son domaine catalytique est de 279 acides aminés localisé entre les acides aminés 133 et 411.
Blast (Basic Local Alignment Search Tool (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)), et ClustalW(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/), ont été utilisés pour déterminer le pourcentage d’identité et d’homologie entre la séquence du domaine catalytique de la protéine kinase LMTK3 et celle de l’insuline récepteur inSR (ID: 1rqq) dans sa conformation DFG-in.
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Figure 27: La localisation du gène LMTK3 au niveau du locus 13q33.33 dans le chromosome
19. (Bandes selon Ensembl, localisations selon GeneLoc).
I.2. Génération de la structure 3D de LMTK3
En l’absence d’une structure expérimentale 3D de LMTK3, une plate-forme contenant les serveurs UniProt(327) et SwissModel(328) (http://swissmodel.expasy.org/workspace/servers) est disponible en ligne. Les deux serveurs sont utilisés respectivement pour extraire la structure primaire du domaine catalytique de la protéine LMTK3 au format FASTA et la modéliser sous la forme d’une structure tridimensionnelle.
I.3. Validation de la structure 3D du LMTK3
L’évaluation de la qualité de LMTK3 DYG-in est une étape cruciale dans la modélisation par homologie. La structure de LMTK3 prédite, a été évaluée par un ensemble de serveurs en ligne:
Prosa server (329) https://prosa.services.came.sbg.ac.at; C’est un puissant outil de recherche
visant à déterminer le repliement naturel d’une protéine. Il détermine la qualité du modèle structurel par le Z-score qui indique la qualité du modèle global.
ProQ: Prédicteur de la qualité des protéines (http://www.sbc.su.se/~bjornw/ProQ/ProQ.cgi).
C’est un réseau de neurones qui est basé sur un certain nombre de caractéristiques structurelles. Il prédit la qualité d'un modèle protéique. ProQ est optimisé pour rechercher et évaluer la structure des protéines correcte. LGscore et MaxSub sont les deux mesures de qualité prédéfinies. LGscore est le log de la valeur P et MaxSub varie de 0 à 1, où 0 est insignifiant et 1 très significatif.
Différentes gammes de qualité de ProQ :
Modèle Correcte Bon modèle Très bon modèle
LGscore> 1.5 LGscore> 3 LGscore> 5
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Saves (Structural Analysis and Verification Server (http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES/)),
c’est un serveur qui offre des résultats en utilisant différents programmes dont les plus intéressants sont:
Verify3D est un programme qui étudie et détermine la compatibilité entre les atomes de la
structure 3D d’un modèle prédit avec sa propre séquence d’acides aminés en 1D à partir des coordonnées atomiques de la structure. L’attribution de la classe structurelle est réalisée en fonction de l’emplacement et de l’environnement de chaque résidu (alpha, bêta, boucle, polaire, non polaire, etc.) et en comparant les résultats à de bonnes structures. La méthode de Verify3D s’appuie sur une collection de structures parfaitement résolues. Cet ensemble de structure est utilisé comme une référence pour obtenir un score des 20 acides aminés(330).
Errat est un programme de vérification des structures protéiques déterminées par
cristallographie. Il analyse les statistiques des interactions non liées entre les différents types d’atomes dans la structure rapportée (comparée à une base de données de structures fiables à haute résolution). Errat permet de déterminer la qualité globale de la structure 3D.
Procheck est un programme qui vérifie la qualité stéréochimique de la structure protéique par
analyse de résidu-par-résidu et la géométrie d'ensemble de la structure, en construisant un diagramme de Ramachandran. Ce diagramme donne une évaluation de la qualité globale de la structure par rapport aux structures bien affinées de la même résolution. Il met en évidence les régions qui peuvent nécessiter des investigations supplémentaires. Les programmes Procheck sont utiles pour évaluer la qualité non seulement des structures protéiques en cours de résolution, mais également des structures existantes et de celles modélisées sur des structures connues.
II. Interaction entre la protéine LMTK3 et un Antagoniste
II.1. Sélection des Ligands
Les similarités de séquences entre les protéines kinases expliquent la conservation élevée des acides aminés dans leurs sites catalytiques. Ce qui laissait présager d’importants problèmes de sélectivité de la part de l’inhibiteur. Par conséquent un inhibiteur peut cibler un sous-groupe de tyrosine kinases. Cette stratégie serait avantageuse dans le cas des protéines kinases dont les inhibiteurs ne sont pas encore identifiés.
Le modèle choisit pour prédire la structure 3D du LMTK3 est un membre de la famille du
récepteur tyrosine kinase (RTK). Ainsi, un groupe de ligands connus comme inhibiteurs de
cette protéine a été sélectionné et téléchargé au format PDB. Ces ligands ont été utilisés comme un outil d'évaluation de la structure 3D prédite par amarrage moléculaire. Les caractéristiques de ces ligands ont été présentées dans le tableau 2.
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Tableau 2: Les ligands utilisés pour évaluer la structure 3D prédite de LMTK3-in.
Ligands (ID en PDB) Récepteur (ID en PDB) Résolution (Å)
112 1rqq 2.6 Å
ANP 1IR3 1.9 Å
IR1 4IBM 1.8 Å
ACP 1I44 2.4 Å
II.2. Docking moléculaire (Réseaux d'Interactions)
L'assemblage et la compréhension des réseaux d’interactions entre les protéines et les ligands sont effectués par l'analyse d’amarrage moléculaire par AutoDockVina(226). Un logiciel conçu pour prédire comment les petites molécules se lient à un récepteur de structure 3D. Le résultat de cet interaction est visualisée par PyMol (331) ; Un logiciel de visualisation de structures chimiques en 3D.
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