Concernant la cycline B1, une très faible expression est détectée lorsque les cellules U251-shScr ne sont pas irradiées (Figure 90). En revanche, 24 h après une irradiation de 8 Gy,
temps pour lequel nous avons montré que 65 % de ces cellules s’arrêtaient en phase G2/M (Figure 87), l’expression de la cycline B1 est fortement augmentée. Puis, celle-ci tend à
diminuer à 48 h et 72 h, lorsque les cellules rentrent progressivement dans le cycle et que la répartition de ces cellules dans le cycle cellulaire revient à son niveau de base (cellules non irradiées) (Figure 87).
Figure 89 : Analyse de la réponse des dommages à l’ADN des cellules U251-shScr, U251-shHAF et U251-shHIF2 après une irradiation (RX) des cellules à la dose de 8 Gy.
A.Illustration représentative des foci H2AX (rouge). Les noyaux cellulaires sont marqués au Hoechst (bleu)
(intercalant de l’ADN). Grossissement 20X, barre d’échelle : 20 µm.
B.Quantification des cellules H2AX positives après une irradiation à la dose de 8 Gy. Moyenne ± ET, n=4 puits
par temps, 4 photos par puits. #p<0,005 vs U251 au temps 2h pour chaque type cellulaire, £p<0,005 vs U251- shScr au temps 14h [HSD de Tukey après une ANOVA à 2 facteur (groupe et temps) significative].
153 Ce profil de variation d’expression de la cycline B1 est différent pour les cellules U251-shHIF2 irradiées (Figure 90). En accord avec la plus faible proportion de cellules arrêtées
en phase G2/M 24 h post-RX (Figure 87), l’augmentation d’expression de la cycline B1 est
plus faible que celle observée à ce temps pour les cellules U251-shScr ; cette expression disparait pratiquement à 48 h et 72 h.
L’analyse de l’expression de la caspase 3 clivée, réalisée pour des temps plus longs post- RX (de 48 h à 120 h), montre une légère augmentation d’expression de cette protéine au cours du temps, pour les cellules U251-shScr, effet qui n’est pas retrouvé pour les cellules U251-shHIF2.
En résumé, l’ensemble de ces expériences montrent que l’extinction de HAF dans les cellules de GB (U251) ne modifie pas la radiosensibilité de ces cellules, contrairement à l’extinction de HIF-2α qui semble rendre ces cellules radiorésistantes. Ces effets pourraient s’exercer à différents niveaux qui participeraient à la diminution de la mort par apoptose de ces cellules.
Conclusion-Discussion
L’hypoxie est un facteur de radiorésistance pour les tumeurs solides. Au regard du rôle majeur des facteurs HIFs dans la réponse cellulaire à l’hypoxie, certaines études ont cherché à identifier quel était le rôle de ces facteurs dans la réponse des cellules tumorales à l’irradiation. En outre, il a été également rapporté qu’une exposition des cellules tumorales aux rayons X conduit à la stabilisation du facteur HIF-1α notamment par la production d’ERO (cf. page 91). En accord avec ces données de la littérature, des résultats issus de l’équipe (non publiés) ont effectivement montré qu’une exposition des cellules de GB (U251) conduisait à une Figure 90 : Immunomarquage de la cycline B1 et de la caspase 3 clivée dans les cellules U251-shScr et
U251-shHIF2 après une irradiation (RX) des cellules à la dose de 8 Gy.
154 stabilisation de HIF-1α mais aussi de HIF2α dans ces cellules et ce en condition de normoxie. Paradoxalement, très peu d’études fondamentales ont été menées sur les cellules issues de GB, pour HIF-1α et aucune à notre connaissance pour HIF-2α, alors que ces tumeurs sont connues pour être particulièrement hypoxiques et radiorésistantes.
Les CSG sont particulièrement résistantes à la radiothérapie, notamment par leur grande capacité à activer les voies de réparation des dommages à l’ADN (Bao et al., 2006). Plus récemment, l’équipe de Pietras a proposé que la voie de signalisation OPN/CD44, impliquée dans le maintien du statut des CSG et dans l’activation de HIF-2α, puisse également être à l’origine de la radiorésistance de ces cellules (Pietras et al., 2014). Ces observations ont conduit à suspecter un rôle de HIF-2 dans la radiorésistance des CSG.
Toutefois, jusqu’à présent, les études restent descriptives et les mécanismes à l’origine de cette radiorésistance ne sont pas encore établis. De plus, aucune étude n’a été menée sur les cellules de GB différenciées. Les résultats présentés dans ce travail, montrent que, suite à l’extinction de HIF-2α, les cellules de GB sont plus radiorésistantes. Comme illustrés sur la
Figure 91, ces effets pourraient s’exercer successivement à différents niveaux qui, en final,
conduiraient à la diminution de la mort par apoptose de ces cellules.
Par ailleurs, dans ces conditions, HIF-1α pourrait être également à l’origine de la radioresistance des cellules U251-shHIF2. En effet, comme nous l’avons énoncé précédemment, des résultats antérieurs obtenus au laboratoire ont montré que les radiations ionisantes favorisent l’expression de ce facteur de transcription. De plus, nous avons également évoqué précédemment (cf. page 76) qu’il pourrait exister une expression compensatoire de HIF-1α dans
155 les U251-shHIF2. Ainsi, une stabilisation de HIF-1α dans les U251-shHIF2, pourrait être renforcée par l’irradiation, favorisant alors la survie des U251-shHIF2.
Ces résultats qui nécessitent d’être confirmés et renforcés par des études mécanistiques complémentaires, pourraient cependant être à rapprocher de ceux de Acker et al., qui proposent que l’effet suppresseur de tumeur de HIF-2α dans les GB serait dû à un effet anti-apoptotique (Acker et al., 2005).
Les dommages à l’ADN radio-induits sont plus faibles dans les cellules U251-shHIF2 suggérant que ces cellules aient des capacités de réparation plus importantes que les cellules contrôles. Des études menées sur des cellules placées en hypoxie ont rapporté une accumulation de H2AX lorsque les cellules expriment une forme stabilisée de HIF-2 (Wrann et al., 2013). Lors de l’activation de la voie de réponse des dommages à l’ADN, l'histone H2AX est phosphorylée par différentes kinases telles, ATM, ATR et la DNA-PK ; Par ailleurs, selon une autre étude réalisée en condition d’hypoxie, il a été montré que la PARP-1, protéine également impliquée dans le contrôle de la réparation de l'ADN, régule l'activité de HIF-1α et de HIF-2α (Gonzalez-Flores et al., 2014). Il pourrait être intéressant d’étudier quelle est la relation entre
HIF-2α et ces différentes protéines.
En parallèle, nous avons, recherché si HAF pourrait moduler la radiosensibilité des cellules de GB. Cependant, aucun effet n’a été observé au cours de cette étude. Les données de la littérature concernant la contribution de ce facteur dans la résistance aux traitements anti-cancéreux sont encore moins nombreuses. Il n’existe aucune étude sur les traitements de radiothérapie. Une seule étude a identifié un rôle potentiel de HAF dans la chimiorésistance des cancers colorectaux (Allen et al., 2012).
Bien que préliminaires, les résultats présentés suggèrent que HIF-2α puisse non seulement participer à la progression tumorale mais également à la réponse au traitement de RT. Toutefois, ces expériences réalisées en condition de normoxie devraient être reproduites en condition d’hypoxie.