L’étude du microenvironnement tumoral a été réalisée ex vivo par immunohistologie et s’est focalisée sur le compartiment vasculaire (Figure 70) et l’inflammation (Figure 71). Ces deux
compartiments ont été étudiés pour les tumeurs issues des deux groupes d’animaux et pour des volumes différents : des tumeurs en phase de croissance et de faible volume (environ 20 mm3) et des tumeurs en fin de croissance de grand volume (environ 100 mm3).
La vascularisation tumorale a été étudiée par immunomarquage de la lame basale des vaisseaux avec un anticorps dirigé contre la laminine (Figure 70 A, illustration représentative
de 3 animaux). Il faut cependant noter que l’anticorps utilisé présente une réaction croisée avec la laminine humaine et de souris. De ce fait, un immunomarquage positif pourra être détecté tant sur les vaisseaux cérébraux que dans le stroma tumoral puisqu’il est connu que les cellules de GB sécrètent de la laminine (McKeever et al., 1989).
Concernant les tumeurs U251-shScr en début de croissance, un réseau vasculaire dense s’organise autour de la tumeur (Figure 70 b). En accord avec les données de la littérature, les
vaisseaux de la tumeur présentent des morphologies différentes de ceux présents dans le tissu sain cérébral. Ce réseau vasculaire se caractérise par des vaisseaux pénétrants à large diamètre et dont la structure ne semble pas intègre. En revanche, au cœur de la tumeur, des vaisseaux de structure beaucoup plus courte sont détectés. En fin de croissance, cette couronne vasculaire est cependant moins dense. De plus, les vaisseaux du cœur de la tumeur finissent par disparaitre (Figure 70 c). Cette faible vascularisation au centre de la tumeur pourrait être à l’origine des
zones de nécrose observées en IRM à ce même temps (Figure 70 d). Cette même analyse
réalisée sur les tumeurs U251-shHAF (Figure 70 f) montre une organisation du réseau
vasculaire différente de celle des tumeurs U251-shScr lorsque les tumeurs ont un faible volume. En effet, ces tumeurs plus compactes sont entourées d’un réseau vasculaire moins dense et absent dans le cœur de la tumeur. En revanche, pour des forts volumes, l’organisation et l’intensité de la vascularisation tumorale associée aux zones nécrotiques sont comparables à celles décrites pour les animaux du groupe contrôle (Figure 70 g et h).
122 Ces observations sont à rapprocher des travaux de Yancopoulos suggérant que la tumeur en croissance s’accompagne d’une angiogenèse mais que celle-ci évoluera, pour des phases plus tardives, vers une masse tumorale avasculaire suite à une régression des vaisseaux au sein de la masse tumorale (Yancopoulos et al., 2000). Le retard de croissance des tumeurs U251-shHAF pourrait être dû à un déficit de suppléance vasculaire lorsque la tumeur commence à se développer. Toutefois, cette faible vascularisation péri-tumorale pourrait être liée également au caractère moins infiltrant de ces tumeurs. En effet, les cellules U251-shHAF sont plus compactes et semble sécréter moins de laminine que les cellules U251-shScr (Figure 70 b et f) ; la laminine, composant de la MEC pouvant servir de support de migration aux cellules
tumorales (Kawataki et al., 2007). Cette hypothèse est également étayée par les observations issues de l’étude de la réaction inflammatoire.
La réaction inflammatoire a été étudiée par immunomarquage des cellules CD68+ qui permet de détecter l’ensemble des cellules inflammatoires (macrophages et microglie). Comme le montre la Figure 71 c et g, lorsque les tumeurs des deux groupes sont en fin de croissance,
les cellules inflammatoires sont préférentiellement localisées sur les pourtours mais aussi au cœur de la tumeur et plus spécifiquement autour des régions nécrotiques et hypoxiques (Leblond et al., 2015). En revanche, l’intensité de la réponse inflammatoire semble différente
Figure 70 : Caractérisation de la vascularisation de faible et fort volume.
a et e : Immunodétection des noyaux cellulaires par un marquage Hoechst (N=2).
b et f : Immunodétection de la lame basale des vaisseaux par un marquage laminine de petit volume (20 mm3). c et g : Immunodétection de la lame basale des vaisseaux par un marquage laminine de fort volume (100 mm3).
d et h : Imagerie pondérée T2w représentative des groupes d’animaux (N=2).
123 entre les tumeurs U251-shHAF et les tumeurs contrôles en phase de croissance. Cette réaction inflammatoire est moins intense pour les tumeurs U251-shHAF (Figure 71 b et f). Comme
nous l’avons évoqué pour la vascularisation, la réaction inflammatoire pourrait être moins stimulée pour ces tumeurs qui sont moins invasives que les tumeurs contrôles en début de croissance.
En résumé, cette étude immunohistologique a permis de montrer que l’inhibition de l’expression de HAF dans les cellules U251 influence l’environnement de ces tumeurs en début de croissance. En effet, les tumeurs de faible volume, issues de l’implantation des cellules U251-shHAF, présentent des caractéristiques différentes des tumeurs contrôles : la masse tumorale est plus compacte, non infiltrante et est associée à une faible vascularisation ainsi qu’à une faible réaction inflammatoire. Afin de proposer une hypothèse mécanistique sous-tendant ces effets, nous avons recherché si l’extinction de l’expression de HAF dans les cellules U251 pouvait moduler l’expression de certains gènes à l’origine du comportement de ces cellules, observé in vivo Dans cet objectif, nous avons étudié in vitro l’expression transcriptomique de gènes cibles des facteurs de transcription HIFs, lesquels sont modulés par HAF.
Figure 71 : Caractérisation de l’inflammation de faible et fort volume.
a et e : Détection des noyaux cellulaires par un marquage Hoechst (N=2).
b et f : Détection de composante inflammatoire par immunodétection de CD68 de faible volume (20 mm3).
c et g : Détection de composante inflammatoire par immunodétection de CD68 de fort volume (100 mm3). d et h : Imagerie pondérée T2w représentative des groupes d’animaux (N=2).
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