Etude de l’action de la protéase sur la gliadine 1. Extraction des gliadines

L’extraction a été réalisée à partir de la farine de cinq graines de blé dur, Triticum durum WAHA et cinq graines de blé tendre, Triticum aestivum HD 1220, broyés au mortier selon la méthode décrite par Singh et al., (1991), cette méthode est basée sur une extraction séquentielle des protéines de réserve selon leur solubilité dans trois solutions de base (Annexe V).

L’extraction des gliadines est réalisée à partir des farines, en ajoutant 1ml de propanol 50% (v/v1) et une incubation pendant 30mn à 65 °C, avec deux agitations intermédiaires à l’aide d’un vortex toutes les 10 mn puis une centrifugation finale à 10 000 rpm pendant 15mn. La deuxième extraction est effectuée sans agitations intermédiaires. La fraction de gliadine présente dans le surnageant est aspirée et évaporée à 65°C pendant 12h.

VII.2. Incubation de l’extrait enzymatique brut avec la gliadine

10 mg de gliadine de blé dur (Waha) et 10mg de gliadine de blé tendre (HD 1220) sont respectivement diluées dans 1ml de tampon citrate phosphate (0,1 M) pH =7,5 et 1ml de l’extrait brut de Nigella Sativa puis soumis à une incubation pendant 2h à 37°C. La réaction est stoppée par l’ajout de 3ml de TCA frais (4%). L’activité protéolytique du mélange est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre Jenway 6315 UV VIS à une longueur d’onde de 750 nm selon le même protocole décrit précédemment par Lenoir et Auberger (1977) et modifiée par Mechakra et al. (1999) dont le protocole est rapporté en annexe N° III.

VII.3. Incubation de la protéase partiellement purifiée avec la gliadine Deux échantillons de 10mg de gliadine de blé dur (Waha) et 10mg de gliadine de blé tendre (HD 1220) sont respectivement incubés à 37°C pendant une durée de 2h, 4h, 8h et 24h dans une solution de 0,5ml de tampon citrate phosphate (0,1 M) pH =7,5 en présence de 0,5 ml d’extrait enzymatique partiellement purifiée de Nigella Sativa. Pour les deux échantillons la réaction est stoppée par addition de 1ml de TCA frais à 4% et le mélange incubé pendant 2h est utilisé pour mesurer l’activité protéolytique à l’aide d’un spectrophotomètre Jenway 6315 UV VIS à une longueur d’onde de 750 nm selon la méthode décrite par Lenoir et Auberger (1977) et modifiée par Mechakra et al. (1999) dont le protocole est rapporté en annexe N° III. Après incubation l’ensemble des échantillons sont analysés par SDS-PAGE et RP-HPLC.

VII.4. Electrophorèse en présence de Sodium Dodécyl sulphate (SDS-PAGE) La séparation des gliadines traités ou non par la protéase partiellement purifiée de la graine de Nigella Sativa est réalisée par électrophorèse monodimensionnelle sur gel vertical, discontinue, en présence d’un détergent anionique SDS suivant la

méthode de Laemmli (1970) modifiée par Payne et al., (1979). Les ponts disulfures sont rompus par l’action du DTT et les liaisons faible sont détruites par le SDS, ce ci abouti à la formation d’un complexe SDS- protéine dénaturée, le SDS a pour but de masquer la charge des protéines par une charge négative, il annule ainsi le fractionnement en fonction de la charge électrique, et assure donc une séparation selon la taille, la conformation et la masse moléculaire.

Le gel de séparation et le de concentration préparés sont coulés, entre deux plaques verticales, en couches superposées (Annexe N° VI). Les peignes à 15 puits sont ensuite délicatement insérés. Après 20 à 40 mn les peignes sont retirés soigneusement pour conserver les puis formés après la prise du gel.

Après préparation des échantillons à analyser, selon le protocole rapporté en annexe N° VI, 50 μl sont déposés dans les puits remplis de solution tampon de migration.

La migration électrophorétique à lieu dans un tampon Tris-glycine (pH 8.3) dans une cuve d’électrophorèse maintenue à une température constante de 10°C, grâce à un système de réfrigération, sous une intensité constante de 80 mA pendant 30 mn. Les protéines chargées négativement migrent vers l’anode et sont séparées en fonction de leur poids moléculaire.

A l’issue de la migration électrophorétique les gels sont récupérés et plongés dans un bain de coloration (Annexe N° VI) sous agitation pendant 24 h. après rinçage à l’eau de robinet, pour éliminer l’excès de colorant, les gels sont décolorés dans un bain contenant une solution de glycérol à 10% pendant 1h sous agitation par la suite ils sont séchés dans une étuve à aération jusqu’à diaphanisation, puis conservés entre deux feuilles de polyéthylène.

L’analyse de plaques est basée sur une lecture phénotypique qui tient compte de la présence et/ou de l’absence des bandes correspondantes aux protéines recherchées.

VII.5. Chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC)

L’analyse des gliadines traités ou non par la protéase partiellement purifiée de la graine de Nigella Sativa a été réalisée par un système d’HPLC (Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography ) qui se compose d’un système de

pompage, d’un injecteur et d’une colonne C18 en phase inverse (TRACER EXTRASIL ODS2, 5μm, 250x 4,6 mm), et d’un détecteur UV à une longueur d’onde de 210 nm. Les différents éléments sont reliés à un micro-ordinateur qui permet de piloter automatiquement les différents composants du système.

L’analyse est effectuée selon la méthode de Lookhart et al. (1986). Un aliquote de chaque échantillon est filtré à travers des filtres Milipores de 0,22μm avant l’analyse. Les échantillons sont injectés à une dose de 20μl avec un débit de 1ml/mn. L’élution consiste à utiliser un gradient linéaire, le premier solvant est composé de 25% acetonitrile et 75% d’eau, chacune contient 0,1% acide trifluoroacetic. La concentration de l’acetonitrile est augmentée à 35% à 5mn, 50% à 10 mn, 75% à 17 mn, 85% à 18 mn, et on retourne à la concentration initiale (25% acetonitrile) à 19 mn. Le temps total entre deux injections est de 30 mn.