Etude de l’effet antioxydant de l’huile fixe de Pistacia lentiscus sur le stress oxydatif

in vivo

IV.2.1.Entretien des animaux

L’étude a été réalisée sur des rats femelles de souches wistar albinos pesant environs 160g. Les rats sont maintenus dans une animalerie à température constante (22°C), hygrométrie de 60% et à un cycle de lumière /obscurité de 12/12h. Ils sont placés dans des cages rectangulaires fabriquées en matière plastique opaque ; comme le protocole ne s’y oppose pas, les animaux ont un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les litières sont remplacées et les cages nettoyées trois fois par semaines.

IV.2.2.Traitement des animaux

Au cours de cette étude ; nous avons utilisé quatre lots d’animaux (n=5):

 Lot 1 : représente le lot contrôle, les animaux de ce lot ont reçu 0,5 ml d’eau potable par

gavage de J-4 à J-1 suivie d’une injection du véhicule (eau physiologique) à J0.

 Lot 2 : représente le lot d’animaux traités par les médicaments anticancéreux. Les animaux

reçoivent pendant 4 jours (j-4 à j-1) par voie orale de l’eau potable. A j0 les animaux ont été traités par les médicaments anticancéreux (doxorubicine à la dose de 5 mg /kg et docétaxel de dose de4mg/kg) par voie Intrapéritonéale (IP).

Lot 3 : représente le lot d’animaux recevant l’association des deux traitements. Les animaux

reçoivent 500µl de (3,125ml/kg/jr) d’huile fixe de fruits de Pistacia lentiscus quotidiennement pendant 4jours (j-4 à j-1) par voie orale suivie à j0 par un traitement en dose unique par les médicaments doxorubicine à la dose de 5mg/kg associée au docétaxel à la dose de 4mg /kg les deux par voie IP. les deux médicaments sont préparés dans l’eau physiologique (NaCl 0.9%).

Lot 4:représente le lot d’animaux prétraités par l’HFPL, reçoit l’huile fruit de Pistacia

lentiscus 500µl de (3,125ml/kg/jr) par animal quotidiennement pendant 4 jours (j-4 à j-1) par voie orale suivie à j0 par un traitement à l’eau physiologique (NaCl 0.9%) représentant le véhicule par voie IP

J-4 : représente le premier jour de prétraitement par huile fixe de fruit de Pistacia lentiscus. J-1 : représente le dernier jour de prétraitement par huile fixe fruit de Pistacia lentiscus. J0 : représente le jour de traitement par les anticancéreux (Doxorubicine, Docétaxel) J7 : représente le jour de sacrifice des animaux.

Chapitre IV Matériel et Méthodes

Figure 13 : Protocole expérimental des traitements IV.2.3.Le prélèvement du sang

Les prélèvements sanguins sont réalisés7émejours après l’administration de la doxorubicine et docétaxel (J7), le sang est prélevé, avec un capillaire dans des tubes à EDTA 2ml environ de sang, par ponction de la veine du sinus rétro-orbital. Le sang est centrifugé à 3000 rpm pendant 12min (EBA20, HetichZentrufugen), puis le plasma est récupéré et congelé à -20°C pour l’analyse des paramètres biochimiques.

IV.2.4.Sacrifice des animaux et prélèvement du foie

Les animaux sont sacrifiés après anesthésie par le chloroforme à 7émejdans le but de prélever le foie. Les organes prélevés, seront bien rincés dans l’eau physiologique puis congelés par la suite à (-20 C°) et conservés pour le dosage des différents paramètres du stress oxydatif.

IV.2.5.Mesure des paramètres du stress oxydatif au niveau du foie

 Préparation de la fraction cytosolique hépatique

Pour préparer la fraction cytosolique, nous avons suivi la méthode décrite par Iqbal et collaborateurs, 2003. Pour cela, 1 g de foie est coupé et homogénéisé avec 3ml du tampon phosphate KH2PO4(0.1M, pH = 7.4) contenant du KCl à 1.17% à l’aide du broyeur de DOUNCE. L’homogénat est ensuite centrifugé à 2000 rmp pendant 15 min à 4°C pour séparer les débris nucléaires et le surnageant récupéré est centrifugé encore une fois à 9600 rmp pendant 30 min à 4°C. C’est le surnageant final ainsi obtenu qui va servir à l’évaluation de l’activité des enzymes antioxydantes (Iqbal et al., 2003).

IV.2.5.1. Mesure du glutathion réduit (GSH)

Pour le dosage du glutathion, la méthode colorimétrique par le réactif d’Ellman (DTNB) est la plus utilisée (Ellman, 1959). Les thiols (-SH) réagissent avec la molécule de DTNB, par rupture de

Chapitre IV Matériel et Méthodes

pont disulfure pour donner le 2-nitro-5-thiobenzoate (TNB-), qui s'ionise au TNB-2 dans l'eau à pH neutre et alcalin. Cet ion de TNB-2 a une couleur jaune.

Figure 14 : Principe de dosage du glutathion (Ellman, 1959).

Le dosage consiste en l’addition de 50 μl de surnageant, dilués dans 10 ml de tampon phosphate (Na2HPO4, 0,1 M ; pH = 8). À 3 ml de ce mélange, 20 μl de DTNB (0,01 M préparé dans le méthanol) sont additionnés ; une couleur jaune se développe après 15 min d’incubation. La lecture de la densité optique est effectuée à 412 nm à l’aide d’un spectrophotomètre (JENWAY 7315 Spectrophotomètre), contre un blanc préparé dans les mêmes conditions avec le tampon phosphate. Les concentrations sont exprimées en millimoles de glutathion par gramme de tissu hépatique. Elles sont déduites à partir d’une gamme étalon de glutathion préparée dans les mêmes conditions que le dosage(Annexe 02, figure 04).

IV.2.5.2.Mesure de l’activité de la glutathion S-transférase (GST)

L’activité enzymatique de la GST est déterminée selon la méthode de Habig et collaborateurs(1974). Elle est étudiée en cinétique. Le substrat utilisé est le chloro-2-4-di nitrobenzène (CDNB) préparé à 20mM dans l’éthanol absolu (100%). L’enzyme permet le transfert du glutathion riche en électron (GSH= GS^-+ H-) sur le CDNB chargé positivement par gain d’un proton (attaque électrophile). La mesure de l’activité enzymatique est effectuée au spectrophotomètre à 340 nm et à 25°C. Dans la cuve de mesure, on introduit 1.7 ml du tampon phosphate (KH2PO4, 0.1M, pH= 6.5) additionnés de 100μl de CDNB (20 mM). Après 10 min d’incubation à 37°C, 100μl de glutathion (20 mM) sont ajoutés et la réaction est déclenchée par l’addition de 100μl de cytosol dilué au 1/100èmeau temps zéro (Habig et al., 1974).

L’augmentation de l’absorbance à 340 nm est enregistrée pendant 5 minutes avec une minute d’intervalle contre un blanc préparé dans les mêmes conditions avec le tampon phosphate.

Chapitre IV Matériel et Méthodes

pont disulfure pour donner le 2-nitro-5-thiobenzoate (TNB-), qui s'ionise au TNB-2 dans l'eau à pH neutre et alcalin. Cet ion de TNB-2 a une couleur jaune.

Figure 14 : Principe de dosage du glutathion (Ellman, 1959).

Le dosage consiste en l’addition de 50 μl de surnageant, dilués dans 10 ml de tampon phosphate (Na2HPO4, 0,1 M ; pH = 8). À 3 ml de ce mélange, 20 μl de DTNB (0,01 M préparé dans le méthanol) sont additionnés ; une couleur jaune se développe après 15 min d’incubation. La lecture de la densité optique est effectuée à 412 nm à l’aide d’un spectrophotomètre (JENWAY 7315 Spectrophotomètre), contre un blanc préparé dans les mêmes conditions avec le tampon phosphate. Les concentrations sont exprimées en millimoles de glutathion par gramme de tissu hépatique. Elles sont déduites à partir d’une gamme étalon de glutathion préparée dans les mêmes conditions que le dosage(Annexe 02, figure 04).

IV.2.5.2.Mesure de l’activité de la glutathion S-transférase (GST)

L’activité enzymatique de la GST est déterminée selon la méthode de Habig et collaborateurs(1974). Elle est étudiée en cinétique. Le substrat utilisé est le chloro-2-4-di nitrobenzène (CDNB) préparé à 20mM dans l’éthanol absolu (100%). L’enzyme permet le transfert du glutathion riche en électron (GSH= GS^-+ H-) sur le CDNB chargé positivement par gain d’un proton (attaque électrophile). La mesure de l’activité enzymatique est effectuée au spectrophotomètre à 340 nm et à 25°C. Dans la cuve de mesure, on introduit 1.7 ml du tampon phosphate (KH2PO4, 0.1M, pH= 6.5) additionnés de 100μl de CDNB (20 mM). Après 10 min d’incubation à 37°C, 100μl de glutathion (20 mM) sont ajoutés et la réaction est déclenchée par l’addition de 100μl de cytosol dilué au 1/100èmeau temps zéro (Habig et al., 1974).

L’augmentation de l’absorbance à 340 nm est enregistrée pendant 5 minutes avec une minute d’intervalle contre un blanc préparé dans les mêmes conditions avec le tampon phosphate.

Chapitre IV Matériel et Méthodes

pont disulfure pour donner le 2-nitro-5-thiobenzoate (TNB-), qui s'ionise au TNB-2 dans l'eau à pH neutre et alcalin. Cet ion de TNB-2 a une couleur jaune.

Figure 14 : Principe de dosage du glutathion (Ellman, 1959).

Le dosage consiste en l’addition de 50 μl de surnageant, dilués dans 10 ml de tampon phosphate (Na2HPO4, 0,1 M ; pH = 8). À 3 ml de ce mélange, 20 μl de DTNB (0,01 M préparé dans le méthanol) sont additionnés ; une couleur jaune se développe après 15 min d’incubation. La lecture de la densité optique est effectuée à 412 nm à l’aide d’un spectrophotomètre (JENWAY 7315 Spectrophotomètre), contre un blanc préparé dans les mêmes conditions avec le tampon phosphate. Les concentrations sont exprimées en millimoles de glutathion par gramme de tissu hépatique. Elles sont déduites à partir d’une gamme étalon de glutathion préparée dans les mêmes conditions que le dosage(Annexe 02, figure 04).

IV.2.5.2.Mesure de l’activité de la glutathion S-transférase (GST)

L’activité enzymatique de la GST est déterminée selon la méthode de Habig et collaborateurs(1974). Elle est étudiée en cinétique. Le substrat utilisé est le chloro-2-4-di nitrobenzène (CDNB) préparé à 20mM dans l’éthanol absolu (100%). L’enzyme permet le transfert du glutathion riche en électron (GSH= GS^-+ H-) sur le CDNB chargé positivement par gain d’un proton (attaque électrophile). La mesure de l’activité enzymatique est effectuée au spectrophotomètre à 340 nm et à 25°C. Dans la cuve de mesure, on introduit 1.7 ml du tampon phosphate (KH2PO4, 0.1M, pH= 6.5) additionnés de 100μl de CDNB (20 mM). Après 10 min d’incubation à 37°C, 100μl de glutathion (20 mM) sont ajoutés et la réaction est déclenchée par l’addition de 100μl de cytosol dilué au 1/100èmeau temps zéro (Habig et al., 1974).

L’augmentation de l’absorbance à 340 nm est enregistrée pendant 5 minutes avec une minute d’intervalle contre un blanc préparé dans les mêmes conditions avec le tampon phosphate.

Chapitre IV Matériel et Méthodes

L’activité spécifique est définie comme étant l’unité d’activité enzymatique par mg de protéines. Une unité d’activité enzymatique est définie comme étant la quantité d’enzyme catalysant la formation de 1 μmol de complexe par minute [constante d’extinction molaire du complexe formé ε = 9.6 mM-1cm-1] (Habig et al., 1974). L’activité spécifique de la GST (μmol/min/mg de protéines) est calculée par la relation suivante :

Sachant que : ΔAbsb340/ΔTmin: différence de l’absorbance à 340 nm Vt: volume total de la cuve (2ml).

Vez : volume de la fraction cytosolique ajouté (0.1ml). F : facteur de dilution 1/100

[Protéines] : concentration des protéines (mg/ml) évaluée par la méthode de Bradford.

IV.2.5.3.Mesure de l’activité enzymatique de la catalase (CAT)

L’activité enzymatique de CAT est déterminée par la méthode de (Clairborne, 1985). Le principe est basé sur la dégradation de l’H2O2en présence de la source enzymatique à 25 °C en eau (H2O) et dioxygène (O2) selon la réaction suivante :

CATALASE

2H2O2 2H2O + O2

La mesure de cette activité a été effectuée par un mélange de 1 ml de tampon phosphate(KH2PO4, 0.1 M, pH 7.2), et la solution de 0.950 ml de peroxyde d’hydrogène (H2O2à 0.019 M) et de 0.025 ml de la source enzymatique(fraction cytosolique). L’absorbance de H2O2est lue à 240nm chaque minute pendant 2 minutes. L’activité enzymatique est calculée en termes d’unité internationale par minute et par milligramme de protéine (UI/min/mg de protéine), selon la formule suivante :

UI/mg de protéine = (2.3033/T) × (log A1/A2) /mg de protéine.

Sachant que :

A1 : Absorbance au temps 0 mn. A2 : Absorbance après 2min. T : Intervalle de temps en minutes.

Chapitre IV Matériel et Méthodes

IV.2.5.4.Mesure de l’activité enzymatique du superoxyde dismutase cytosolique (Cu/Zn SOD)

L’évaluation de la SOD est réalisée sur le cytosol par la méthode de Beauchamp et Fridovich (1971). Un mélange est constitué de 2 ml du mélange réactionnel contenant (Cyanide de Sodium 2 x10-5M, solution de NBT (nitroblue de tetrazolium) à 1.76x 10-4M, EDTA 66 mM, Methionine 10 -2M, Riboflavine 2 μM, pH 7.8) et 5μl de cytosol. Ce mélange est exposé à la lumière d’une lampe de 15 Watt pendant 10 min pour induire la photoréaction de la riboflavine et del’O2. La réduction du NBT par les anions superoxyde en formazan est suivie par le spectrophotomètre à 560 nm. L’activité enzymatique est calculée en termes d’UI/mg de protéines, selon la formule suivante :

% d'inhibition = [(abs du control – abs de l'essai)/ abs du control] x 100 SOD UI/ml = % d'inhibition × 6,35

IV.2.5.5.Mesure du malondialdéhyde (MDA) tissulaire ou test TBARS

Le dosage de MDA est réalisé selon la méthode décrite par Okhawa et collaborateurs en 1979. Cette méthode utilise l’acide thiobarbiturique (TBA). En effet, la détection du MDA présent dans les échantillons biologiques se base sur la réaction au cours de laquelle, deux molécules de TBA réagissent avec une molécule de MDA ce qui entraîne la formation d’un complexe coloré en rose susceptible d’un dosage spectrophotométriques.

Figure 15 : Principe de dosage du MDA(Okhawa, 1979).

Chapitre IV Matériel et Méthodes

IV.2.5.4.Mesure de l’activité enzymatique du superoxyde dismutase cytosolique (Cu/Zn SOD)

L’évaluation de la SOD est réalisée sur le cytosol par la méthode de Beauchamp et Fridovich (1971). Un mélange est constitué de 2 ml du mélange réactionnel contenant (Cyanide de Sodium 2 x10-5M, solution de NBT (nitroblue de tetrazolium) à 1.76x 10-4M, EDTA 66 mM, Methionine 10 -2M, Riboflavine 2 μM, pH 7.8) et 5μl de cytosol. Ce mélange est exposé à la lumière d’une lampe de 15 Watt pendant 10 min pour induire la photoréaction de la riboflavine et del’O2. La réduction du NBT par les anions superoxyde en formazan est suivie par le spectrophotomètre à 560 nm. L’activité enzymatique est calculée en termes d’UI/mg de protéines, selon la formule suivante :

% d'inhibition = [(abs du control – abs de l'essai)/ abs du control] x 100 SOD UI/ml = % d'inhibition × 6,35

IV.2.5.5.Mesure du malondialdéhyde (MDA) tissulaire ou test TBARS

Le dosage de MDA est réalisé selon la méthode décrite par Okhawa et collaborateurs en 1979. Cette méthode utilise l’acide thiobarbiturique (TBA). En effet, la détection du MDA présent dans les échantillons biologiques se base sur la réaction au cours de laquelle, deux molécules de TBA réagissent avec une molécule de MDA ce qui entraîne la formation d’un complexe coloré en rose susceptible d’un dosage spectrophotométriques.

Figure 15 : Principe de dosage du MDA(Okhawa, 1979).

Chapitre IV Matériel et Méthodes

IV.2.5.4.Mesure de l’activité enzymatique du superoxyde dismutase cytosolique (Cu/Zn SOD)

L’évaluation de la SOD est réalisée sur le cytosol par la méthode de Beauchamp et Fridovich (1971). Un mélange est constitué de 2 ml du mélange réactionnel contenant (Cyanide de Sodium 2 x10-5M, solution de NBT (nitroblue de tetrazolium) à 1.76x 10-4M, EDTA 66 mM, Methionine 10 -2M, Riboflavine 2 μM, pH 7.8) et 5μl de cytosol. Ce mélange est exposé à la lumière d’une lampe de 15 Watt pendant 10 min pour induire la photoréaction de la riboflavine et del’O2. La réduction du NBT par les anions superoxyde en formazan est suivie par le spectrophotomètre à 560 nm. L’activité enzymatique est calculée en termes d’UI/mg de protéines, selon la formule suivante :

% d'inhibition = [(abs du control – abs de l'essai)/ abs du control] x 100 SOD UI/ml = % d'inhibition × 6,35

IV.2.5.5.Mesure du malondialdéhyde (MDA) tissulaire ou test TBARS

Le dosage de MDA est réalisé selon la méthode décrite par Okhawa et collaborateurs en 1979. Cette méthode utilise l’acide thiobarbiturique (TBA). En effet, la détection du MDA présent dans les échantillons biologiques se base sur la réaction au cours de laquelle, deux molécules de TBA réagissent avec une molécule de MDA ce qui entraîne la formation d’un complexe coloré en rose susceptible d’un dosage spectrophotométriques.

Chapitre IV Matériel et Méthodes

Pour ce dosage, 0,5 ml TCA à 20% et 1ml du TBA 0,67% (0,67% dans le NaOH 2N) sont ajoutés à 0,5 ml d’homogénat. Le mélange est chauffé à 100°C pendant 15 minutes, il est ensuite refroidi puis additionné de 4 ml de n-butanol et centrifugé à 3000 rpm pendant 15 minutes. La densité optique est déterminée sur le surnageant au spectrophotomètre à 530 nm.

Les concentrations du MDA sont déduites à partir d’une gamme étalon préparée dans les mêmes conditions en utilisant le tétraethoxypropane (TEP) qui donne le MDA après leur hydrolyse.

Calcule les concentrations du MDA selon la formule suivant :

[MDA µM/g] = DO/0,0184 IV.2.6.Dosage des protéines totales

Les protéines totales sont dosées par la méthode de Bradford (1976). Cette méthode est basée sur le changement de la coloration du réactif du Bradford, bleu brillant de coomassie, qui développe en présence des protéines une coloration bleu quantifiable à 595 nm. Et dont l’intensité est proportionnelle à la quantité des protéines présentes dans l’échantillon. La fraction cytosolique est au préalable diluée au 1/10èmedans l’eau distillée. 100μl d’échantillon dilués sont ensuite ajoutés à 4 ml du réactif de Bradford (BBC). Après agitation la réaction se produit à température ambiante pendant cinq minutes puis l’absorbance est lue à 595 nm.

Les résultats sont déterminés à partir d’une droite d’étalonnage de protéines standards obtenus avec l’albumine sérique bovine (BSA) (utilisée aux concentrations 0,062 à 2 mg/ml) (Annexe 02, figure 03) et sont exprimés en mg/ml (Bradford, 1976).