Etude de la dimérisation par RMN

Les spectres 1_H-15_{N HSQC du dimère pur et du monomère pur montrent des différences importantes}

(Figure IV.7A et B). En effet, la gamme des déplacements chimiques est plus petite dans le spectre du monomère que dans le spectre du dimère et la dispersion des résonances est moins importante dans le spectre du monomère. De ce fait on peut conclure que le monomère est moins structuré que le dimère.

Figure IV.7 : Comparaison des spectres 1_H-15_{N HSQC du dimère pur à 1,1 mM (A) et du monomère pur ) à 1 mM}

L’enregistrement et l’analyse de spectres RMN 1_H-15_{N HSQC du monomère, du monomère réduit et}

du monomère réduit auquel 0.5, 1 et 1.5 équivalents de Zn2+ _{ont été rajoutés ont permis de confirmer les}

résultats obtenus par dichroïsme circulaire (Figure IV.8A et B). Les spectres du monomère oxydé et du monomère réduit se superposent bien. Les gammes de déplacements chimiques 1_{H et} 15_{N restent les mêmes}

dans les deux formes ce qui indique qu’il n’y a pas de structuration particulière lors de la réduction du monomère par du DTT. Ces résultats confirment ceux préalablement obtenus par dichroïsme circulaire. Les différences principales observées se situent au niveau des résidus proches des cystéines (Figure IV.8) qui se situent, si l’on se réfère au dimère, près d’un feuillet β pour les cystéines 92 et 95 et dans la queue C terminale pour les cystéines 132 et 137.

Figure IV.8 : Spectre 2D 1_H-15_{N HSQC de FUR monomère 1 mM oxydé (A en noir) et réduit par 20 équivalents de}

DTT (A en rouge) et du monomère réduit par 20 équivalents de DTT auquel 1,5 équivalents de Zn2+ ont été ajoutés (B). La réduction des cystéines n’entraîne pas d’importants changements conformationnels. Des changements sont visibles pour les résidus proches des cystéines. Les résidus indiqués en A) sont issus de l’attribution des résonances du monomère. L’ajout de Zn2+ _{sur le monomère réduit entraîne d’importants changements de structure comme on peut le}

voir sur le spectre B. On retrouve le spectre du dimère mais la dimérisation n’est pas totale du fait de la présence de DTT en excès qui complexe le Zn2+_{. L’augmentation de la dispersion des résonances indique une augmentation de la}

structuration des sous-unités lors de la dimérisation avec notamment la formation de structures en feuillet β.

Par contre, l’ajout d’un excès de Zn2+ _{modifie fortement l’aspect du spectre. On constate un}

élargissement de la gamme des déplacements chimiques 1_{H et} 15_{N qui traduit clairement une structuration de}

la protéine avec l’incorporation du Zn2+_{. La RMN confirme donc les résultats apportés par le CD. De}

nombreux pics apparaissent dans une zone du spectre (entre 8,5 et 9,4 ppm 1_{H et entre 127 et 131 ppm} 15_N)

qui comprend usuellement des résidus organisés en brins β. Si l’on compare le spectre obtenu avec les spectres du monomère réduit et du dimère, on retrouve les ensembles de pics de chaque forme. L’échantillon est donc composé d’un mélange de dimère et de monomère ce qui indique que la dimérisation n’est pas

totale. Par contre, l’observation des pics du dimère « natif » permet de conclure que le dimère formé in vitro est identique au dimère natif.

La superposition des spectres 1_H-15_{N HSQC du monomère et du dimère (Figure IV.9) montre}

que les résidus pour lesquels les changements de déplacement chimique sont les plus importants, sont situés majoritairement dans le domaine C terminal de la protéine.

Figure IV.9 : Superposition des spectres 1_H-15_{N HSQC du dimère (en vert) et du monomère (en magenta). Les}

résonances attribuées correspondent uniquement aux résidus du domaine C terminal du dimère. La structuration intervenant lors de la dimérisation concerne très majoritairement les résidus du domaine C terminal de FUR. L’attribution de la région centrale n’est pas indiquée pour plus de clarté.

En conclusion, les résultats de dichroïsme circulaire et de RMN nous indiquent que les formes monomères oxydées et réduites sont très proches. Les deux techniques indiquent que lors de la réduction, il n’y a pas de changements structuraux importants et la RMN montre que les modifications principales se localisent au niveau des résidus proches des cystéines. L’incorporation de Zn2+ _{par le monomère réduit}

entraîne une structuration importante de la protéine avec la formation d’hélice α mais également de brins β conduisant à la dimérisation de la protéine. L’analyse des spectres HSQC montre que le dimère formé est identique au dimère natif.

Afin de mieux comprendre les réorganisations structurales intervenant lors de la dimérisation, nous avons réalisé l’attribution des résonances de la chaîne principale du monomère oxydé pour localiser et identifier les structures secondaires.

IV.4

La stratégie d’attribution utilisée pour le dimère a été répétée pour le monomère avec un échantillon doublement marqué 15_N/13_{C à ∼1,7 mM. Le tampon est globalement le même que celui utilisé pour le dimère.}

La seule différence réside dans l’ajout d’EDTA à 20 mM. Ce chélatant des métaux permet de stabiliser la protéine en empêchant sa dégradation qui passe notamment par la protéolyse des 9 premiers résidus. Cette protéolyse survient en absence d’EDTA mais est fortement retardée en sa présence. Elle peut être issue d’une autoprotéolyse métal dépendante soit d’une protéolyse due à la présence de bactéries sécrétant des protéases métal dépendantes.

Figure IV.10 : Comparaison de la stabilité à 25°C du monomère de FUR à 1 mM dans MOPS 100 mM KCl 500 mM pH 7 en absence (A) ou en présence (B) d’EDTA 20 mM.

L’attribution du domaine N-terminal du monomère a été réalisée sans difficultés majeures. L’analyse des déplacements chimiques secondaires des CO et Cα a permis de déduire la présence de 4 hélices α (résidus 5 à 9, 17 à 24, 35 à 44, et 51 à 63) et de deux brins β (résidus 67 à 71, et 76 à 80) (Figure IV.12). Le domaine C-terminal quant à lui a posé beaucoup plus de problèmes. Seuls 29 résidus sur 67 ont pu être

attribués. Les déplacements chimiques secondaires n’ont pas permis d’identifier clairement de structures secondaires présentes dans ce domaine C terminal. Sachant que 16 pics manquent dans l’1_H-15_{N HSQC, on}

peut supposer que le domaine C terminal est en échange conformationnel et n’est donc pas bien structuré en absence d’interaction protéine-protéine. Ceci concorde bien avec le fait que ce domaine est impliqué dans la dimérisation de FUR.

Figure IV.11 : Spectre HSQC 1_H-15_{N du monomère avec l’attribution}

Les déplacements chimiques secondaires obtenus pour le monomère (Figure IV.12) montrent que le domaine C-terminal du monomère est peu structuré. De ce fait, comme le suggérait la superposition des spectres 1H-15N HSQC du dimère et du monomère (Figure IV.9), la dimérisation modifie beaucoup la structure du domaine C terminal de FUR. Au niveau du domaine N-terminal, les déplacements chimiques secondaires permettent de déterminer la présence des hélices α2, α3 et α4 et des brins β1 et β2 (Figure IV.12) identifiés dans le dimère. D’ailleurs, la comparaison des déplacements chimiques secondaires obtenus pour le monomère et le dimère montre que le domaine N terminal est très proche dans les deux formes

(Figure IV.13). Une différence importante se situe au niveau des premiers résidus attribués (5 à 9) qui sont non structurés dans le dimère et forment une hélice α dans le monomère.

Figure IV.12 : Superposition des valeurs des déplacements chimiques secondaires (delta = δexp-δrandom coil) obtenues

pour les noyaux CO (barres vides) et Cα (barres pleines) du monomère. Plusieurs résidus successifs ayant un delta positif sont organisés en hélice α et plusieurs résidus successifs ayant un delta négatif sont organisés en brin β.

Figure IV.13 : Différences des valeurs des déplacements chimiques secondaires CO (barres vides) et Cα (barres pleines) du monomère et du dimère (Δdelta = deltamonomère – deltadimère). Les structures secondaires identifiées pour chaque

formes sont représentées en haut pour le monomère et en bas pour le dimère. Les structures secondaires du domaine N- terminal sont globalement identiques dans les deux formes. La grande différence réside dans la présence d’une hélice α N-terminale (résidus 5 à 9) présente dans le monomère et absente dans le dimère.

Pour apporter plus de renseignement sur le comportement du domaine C-terminal et aussi pour vérifier notre attribution, nous avons mesuré les NOEs hétéronucléaires à 600 MHz sur le dimère et le monomère. Ces données vont nous permettre d’avoir des informations sur la dynamique du dimère et du