Etude cryo-microscopique de nos formulations

2.2.1 Observation des différentes zones du diagramme de phase

Exemple : Cas de solutions à 10% (m/m) et 50% (m/m) de PVP

Les échantillons de solutions à 10% (m/m) et 50% (m/m) de PVP ont été choisis pour l’observation cryo-microscopique de l’état physique du binaire eau+PVP afin de visualiser deux principales zones du diagramme de phase (figures 44 et 45).

Descente en température

Solution à 10% (m/m) de PVP Solution à 50% (m/m) de PVP

a) Etat liquide à -16,60°C b) Etat liquide à -12,20°C

c) Cristaux et liquide cryo-concentré à -20,50°C d) Etat amorphe (supposé) à -102,70°C

Figure 354 : Cryo-micrographies des solutions à 10% (m/m) (a et c) et 50% (m/m) (b et d) du polymère PVP lors de la descente en température

100 μm _{100 μm}

100 μm 100 μm

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Montée en température

Solution à 10% (m/m) de PVP Solution à 50% (m/m) de PVP

e) Pas de changements à -32,70°C f) Nucléation et croissance de la glace à -32,70°C

Figure 365 : Cryomicrographies des solutions à 10% (m/m) (e) et 50% (m/m) (f) de PVP lors de la remontée en température

La figure 44 présente l’évolution de l’état des solutions à 10 (m/m) et 50% (m/m) de PVP au cours du refroidissement et la figure 45 présente l’évolution de ces mêmes solutions au cours de la remontée en température. A l’aide de ces images, on peut remarquer que les deux solutions restent à l’état liquide jusqu’à la température de -16°C (a et b).

Lorsque la descente en température progresse, pour l’échantillon à 10% (m/m) de PVP, une cristallisation est observée à -18,4°C avec une propagation très rapide du front de cristallisation (c). On note une faible différence de température avec celle du diagramme de phase lue sur la Figure 41 (environ -0.2°C) pour différentes raisons : (i) en MDSC, il s’agit d’une température de fusion "finissante", en cryo-microscopie c’est une température de cristallisation « commençante » ; (ii) la différence de géométrie et de nature du support (capsule en aluminium en MDSC, creuset en quartz en cryo-microscopie) peut engendrer des effets de surface différents.

Dans le cas de l’échantillon à 50% (m/m) de PVP, on ne note aucune différence entre les images obtenues à l’état liquide (Cf Fig. 44 b) et à l’état amorphe (Cf Fig. 44 d). Ce comportement est caractéristique du phénomène de vitrification selon Zhivotova et al., 2007, car la densité optique entre les deux états ne change quasiment pas.

Lors de la rampe de chauffe, la nucléation de la glace a été observée aux alentours de -45°C ; de nombreux sites de nucléation apparaissent à l’image et se propagent au fur et à mesure que la température augmente jusqu’à occuper toute la surface de l’échantillon à -32,70°C, comme le montre la figure 45 (f). Dans le cas de l’échantillon à 10% (m/m) de PVP, aucun changement n’a été observé. Ces résultats confirment le phénomène de recristallisation observé par la DSC dans la région IV du diagramme de phase.

Ainsi, les observations cryo-microscopiques réalisées avec notre système binaire eau+PVP confirment raisonnablement les conclusions faites à partir des analyses des données expérimentales de DSC concernant les différents états physiques de nos formulations choisies pour la lyophilisation.

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2.2.2 Observation des différentes phases du thermogramme de l’échantillon à 50% (m/m) de PVP

Le cas particulier de la solution à 50% (m/m) de PVP a été étudié plus précisément durant chaque phase de changement d’état afin de s’assurer que ces résultats soient bien reproductibles et afin de relier chaque étape du thermogramme figure 42 avec des observations cryo-microscopiques.

Etat initial, état liquide :

Figure 376 : Echantillon à 50% (m/m) de PVP à l’état initial liquide à 7,4°C

Pendant refroidissement (en dessous de Tf)

Figure 387 : Echantillon à 50% (m/m) de PVP durant la rampe de refroidissement sous la température normale de cristallisation à -27,3°C à gauche et -55,0°C à droite

Apparition 1ers nucléi

Figure 398 : Echantillon à 50% (m/m) de PVP durant la remontée en température avec apparition des premiers nucléi à -44,1°C

100 μm

100 μm _{100 μm}

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Croissance :

Figure 49 : Echantillon à 50% (m/m) de PVP croissance des cristaux de -39,7°C à gauche, à -35,3°C au milieu et à -32,5°C à droite

Fusion :

Figure 400 : Echantillon à 50% (m/m) de PVP durant la fusion progressive des cristaux de glace. Fusion commençante à -11,4°C en haut à gauche, à -9,0°C en haut à droite, à-7,5°C en bas à gauche et à -6,8°C en bas

à droite

26 μm 26 μm _{26 μm}

100 μm 100 μm

125

Liquide :

Figure 411 : Echantillon à 50% de PVP, fin de la fusion, disparition des derniers cristaux de glace à -1,8°C à gauche, état liquide à 4,0°C à droite

Ces images (figures 46 à 51) apportent de nombreuses preuves complémentaires sur le comportement de la solution à 50% de PVP lors des différentes étapes de congélation et de fusion qui se déroulent au cours des analyses de DSC. Malheureusement, l’observation cryo-microscopique ne permet pas la détection de la vitrification de l’échantillon même si l’on peut supposer, d’après le thermogramme de la figure 41, qu’elle se déroule aux alentours de -70°C. En revanche, ces observations confirment que l’échantillon ne présente pas de signes de cristallisation lors de la descente en température. C’est bien lors de la phase de remontée en température lorsque les molécules d’eau piégées dans le réseau polymériques vont disposer des degrés de liberté et de l’énergie suffisante que la cristallisation se fait en totalité. Cette cristallisation est directement suivie de la fusion complète des cristaux formés à partir de -11,5°C, jusqu’à leur disparition totale aux alentours de -1,8°C. Enfin, lorsque l’échantillon dépasse la température de 0°C, il revient à son état liquide initial.

Ainsi, notre cas particulier étudié permet de mettre en lumière le comportement de ce type de solution de polymère lorsque celle-ci devient très concentrée. Cette connaissance permet de choisir rationnellement les paramètres de congélation des formulations cryoprotectrices en vue de la lyophilisation. Avec cette solution concentrée, il sera, a priori, aussi nécessaire de pratiquer une étape de recuit comme décrit précédemment afin de s’assurer que toute la masse d’eau congelable soit bien cristallisée au moment de la sublimation et donc d’éviter des phénomènes de recristallisation lors des remontées en températures. De plus, ces phénomènes parasites de recristallisation pourraient éventuellement causer des stress et des dommages aux cellules et engendrer de plus faibles rendements en termes d’activité et de concentration cellulaire.

Par ailleurs, on observe que ce mélange eau+PVP présente la particularité d’avoir une valeur de la température T’g assez élevée qui permettra une sublimation de la glace à vitesse relativement élevée, ce qui est intéressant d’un point de vue du coût global du procédé de lyophilisation. Au vu de ces premiers résultats, il nous a ensuite semblé important d’étudier l’influence d’un ajout de lactose, qui est très utilisé en lyophilisation, sur les propriétés de notre formulation aqueuse avec le polymère PVP. Les propriétés de la formulation ternaire eau+PVP+lactose obtenue font l’objet du paragraphe suivant.

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3 Etude du ternaire eau+PVP+lactose

Pour un système ternaire eau+PVP+lactose, le diagramme de phase présente, à coup sûr, certaines différences par rapport à celui du système binaire (eau+PVP) en raison du fait que la phase vitreuse est très probablement constituée des trois composants. Afin de comprendre l’influence du lactose sur les systèmes binaires PVP+eau, nous avons analysé par MDSC différents échantillons ternaires contenant trois concentrations massiques différentes en lactose, à savoir : 5%, 10% et 15% en masse. Les températures de fusion, les températures de transitions vitreuses des formulations cryoconcentrées au maximum, notées T’g, et les enthalpies de fusion ont été extraites des thermogrammes de MDSC obtenus.