Choix des excipients

Le tréhalose apparait être un excellent protectant d’après les études précédemment citées. C’est un sucre réducteur antioxydant qui serait naturellement protecteur contre la dessiccation des cellules et les stress oxydatifs. Cependant, son utilisation est légèrement plus coûteuse que d’autres sucres et la législation de certains pays ne permet pas son utilisation dans des produits alimentaires (Espagne). Ce produit a donc été écarté de notre liste. Cependant, l’utilisation d’un sucre semble indispensable pour la bonne conservation des cellules. De plus, d’après les données de la littérature, Champagne et al., 1996; de Vos and Vaughan, 1994; Livney, 2010, le lactose (l’un des composant principal du lait), qui est déjà couramment utilisé dans l’industrie des bactéries lactiques, nous a semblé un bon protectant, également efficace pour la conservation des lyophilisats. Notre choix s’est donc tout d’abord porté sur l’utilisation du lactose comme sucre protectant de base. Cependant, Champagne et al., 1996; Takahashi et al., 1988 ont montré que l’utilisation d’un polymère comme cryoprotectant permettait de meilleurs résultats quant à la stabilisation des cellules. Notre choix s’est donc porté sur un excipient bien connu de l’industrie pharmaceutique, le polyvinylpyrrolidone (PVP), un polymère de haut poids moléculaire, doté de longues chaines polymériques qui permettraient d’envelopper convenablement les cellules et de les protéger à la fois durant l’opération de déshydratation ainsi que pendant le stockage du lyophilisat.

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1.2.1 Le lactose

Le lactose est un disaccharide constitué de glucose et de galactose. Il est bien connu et très utilisé en tant qu’additif dans l’industrie alimentaire, notamment dans les charcuteries et les plats cuisinés, ainsi que comme excipient dans l’industrie pharmaceutique. Son usage, très largement répandu, permet une adaptation très rapide sur le marché, sans problèmes de restrictions (Fan and Roos, 2015). Cependant, ces dernières années, l’usage du lactose a été assez controversé, en raison d’une recrudescence de problèmes d’allergies et d’intolérances avec certaines personnes. Il est donc important de noter qu’il existe une tendance de plus en plus forte à proposer sur le marché des produits finis contenant des excipients et des conservateurs tolérables par la plus grande partie de la population (Nag and Das, 2013a).

Le lactose qui a été utilisé dans cette étude est le D-Lactose monohydrate. En effet, la cristallisation du lactose peut produire 2 types d’isomères, la forme α et la forme β. La forme α (monohydrate) du lactose est la plus couramment utilisée en raison de sa forte disponibilité et de son coût plus faible, l’autre forme polymorphe β-lactose anhydre étant plus rare (Listiohadi et al., 2009). Le tableau 4 résume les principales informations concernant les produits utilisés lors de ces travaux de recherche.

1.2.2 Le Polyvinylpyrrolidone (PVP) K30

Le polyvinylpyrrolidone est un polymère réputé pour sa très grande solubilité dans l’eau et il est utilisé dans de très vastes domaines d’applications, allant de la cosmétique à la production de formes pharmaceutiques. Ces propriétés sont nombreuses : agent stabilisant, dispersant, vitrifiant, épaississant etc (“Handbook of Pharmaceutical Excipients – 7th Edition,” 2013) .C’est aussi un produit de qualité alimentaire couramment utilisé dans de nombreuses industries. Notre choix s’est porté sur ce polymère pour plusieurs raisons. Tout d’abord, sa température de transition vitreuse est très élevée (autour de 168°C) qui peut être un excellent atout pour un stockage des lyophilisats à température ambiante. De plus, en présence d’eau et à basse température, il a tendance à donner des milieux vitrifiés, permettant, à l’aide de ses longues chaines polymériques, de piéger les cellules à l’intérieur de la matrice lyophilisée, et de réaliser ainsi une protection contre l’oxydation et la diffusion moléculaire. De plus, cette mise en forme pourrait permettre de ralentir la réhydratation des cellules et de limiter les stress dus à une rentrée d’eau trop rapide.

La gamme K du PVP, dépend surtout de la masse molaire de l’espèce. Nous avons fait le choix du K30 surtout en raison du milieu de gamme (K15 ; K17 ; K25 ; K30 et K90), afin d’avoir un produit à la fois facile à manipuler et présentant néanmoins les bonnes propriétés d’usage liées au PVP. Cependant à forte concentration (>50%) dans l’eau, sa viscosité augmente très rapidement ce qui rend son usage très difficile et peu pratique.

1.2.3 Solution saline (NaCl 0,85%)

Lors du lavage et des dilutions des solutions bactériennes, il est important de maintenir les bactéries dans une solution isotonique, de sorte que l’équilibre osmotique, de part et d’autre de la membrane, soit maintenu. Des solutions salines sont généralement utilisées, ou encore des tampons à base de phosphate. Dans le cas de notre étude, des solutions de chlorure de sodium à 0,85% ont été utilisées, et réalisées par nos soins en diluant 8,5g de NaCl extra pur dans 1000mL d’eau distillée. Chaque

92 solution a donc été stérilisée à l’autoclave à 121°C pendant au moins 15 minutes et ensuite maintenue hermétiquement fermée avant utilisation.

1.2.4 Milieu de culture (MRS)

Le milieu de culture MRS est un milieu développé par De Man, Rogosa and Sharpe (Corry et al., 2003). Il contient tous les éléments nutritifs nécessaires à la croissance des lactobacilles. Le milieu était composé de :

-Peptone, 20g/L -Extrait de levures, 5g/L

-Glucose, 20g/L -Polysorbate (Tween 80), 1,08g/L -Phosphate dipotassique, 2g/L -Acétate de sodium, 5g/L

-Citrate d’ammonium, 2g/L -Sulfate de magnésium, 0,2g/L -Sulfate de manganèse, 0,05g/L

Il se présente sous forme d’une poudre qu’il faut dissoudre dans de l’eau distillée (55,3g/L). Le milieu peut être utilisé sous forme liquide après stérilisation, mais il peut aussi être utilisé sous forme gélifiée en y ajoutant 15g/L d’agar bactériologique et en coulant le milieu à chaud dans des boites de Pétri. Le pH initial du milieu indiqué par le fournisseur est de 6,4 r 0,2.

Tableau 4 : Tableau récapitulatif des produits utilisés pour les recherches

Nom Chimique Source Masse molaire Numéro CAS Formule Brute D-Lactose Monohydrate Cooper 360,31 g.mol-1 10039-26-6 C12H22O11 · H2O Polyvinylpyrrolidone (PVP) BASF 44000-54000 Da 9003-39-8 (C6H9NO)n

Chlorure de Sodium, extra pur Acros Organics 58,44 g.mol-1 7647-14-5 NaCl Agar Bactériologique type E Biokar Diagnostics Non renseignée 9002-18-0 (C12H18O9)n

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2 Equipements du laboratoire