5.2.1 En suivant le quenching du tryptophane des LDL
La fixation de la phtalocyanine d’aluminium disulfonée à proximité immédiate de l’apoprotéine des LDL, voire directement à celle-ci, sera détectée en suivant les modifications de fluorescence intrinsèque des lipoprotéines. En effet, comme dans le cas de la deutéroporphyrine, il existe un recouvrement important entre le spectre d’émission des LDL (maximum autour de 330 nm) et le spectre d'absorption de la phtalocyanine (maximum 375 nm).
Figure 5.3 : Quenching de la fluorescence intrinsèque des LDL (λex = 280 nm) induit par la fixation de la phtalocyanine : Spectres de fluorescence des LDL (4×10-8 M) en fonction des quantités croissantes de phtalocyanine d’aluminium disulfonée ajoutées, c’est à dire de la concentration totale en phtalocyanine (PT). PT/LDL = 0 ; 2,2 ; 4,4 ; 5,5 ; 6,6 et 8,8.
La figure 5.3 montre que l’association aux LDL de la phtalocyanine d’aluminium disulfonée induit effectivement une diminution de l’intensité de la fluorescence intrinsèque des lipoprotéines. Cette diminution est fonction de la concentration en phtalocyanine ajoutée à la solution de LDL. Comme dans le cas de la deutéroporphyrine, cette diminution nous permet de mettre en évidence l’existence d’une fixation de classe P sur ou à proximité de l’apoprotéine. Les paramètres de cette interaction ont été déterminés de la même façon, en utilisant la méthode de Nishida [35].
Figure 5.4 : Quantification de l’association de la phtalocyanine d’aluminium disulfonée aux LDL en suivant les changements de la fluorescence à 330 nm, excitée à 280 nm. Les points ont été calculés selon la méthode de Halfman et Nishida, et représentés en accord avec la méthode classique de Scatchard.
La représentation de Scatchard des données obtenues est montrée figure 5.4. Environ 5 sites de classe P sont mis en évidence. La constante d’affinité correspondant à ce premier type de fixation est de KP =5×107 M-1, chaque site a donc une affinité intrinsèque de l’ordre de 1×107 M−1.
5.2.2 En suivant les changements de fluorescence de l’AlPcS2 : schéma global de la fixation
Nous avons ensuite suivi les changements du spectre d’émission de la phtalocyanine d’aluminium disulfonée (1,75×10-7 M) induits par des ajouts de quantités croissantes de LDL (figure 5.5). Les solutions utilisées sont à des concentrations suffisamment faibles pour qu’aucun effet d’écran ne se produise. La fluorescence de chaque espèce en solution est donc directement proportionnelle à sa concentration.
Interaction phtalocyanine - LDL
Figure 5.5 : Spectres de fluorescence de AlPcS2 (1,75×10-7 M) en présence de différentes quantités de LDL. Longueur d’onde d’excitation : 375 nm. Concentrations en LDL : 0, 10, 15, 20, 30, 40, 50 et 100 ×10-9 M. La flèche indique la direction des changements de spectre pour une augmentation de la quantité de LDL.
Les données sont analysées de la même façon que celles correspondantes dans le cadre de l’interaction DP-LDL, c’est à dire à partir de l’équation (4.6) en notant respectivement PB et PL les concentrations en phtalocyanine associée aux LDL et libre dans la solution :
LDL P P K F B LDL = ⋅
En définissant F∝ et F0 comme les intensités de fluorescence à 677 nm correspondant à 0% (pas de LDL dans la solution) et 100% (LDL en excès) de molécules associées aux LDL, cette relation s’écrit alors :
( )
(
F F)
LDL F F K 0 LDL ⋅ − − = ∞ (5.1) où F est l’intensité de fluorescence à 677 nm d’une solution obtenue par l’ajout d’une quantité donnée de LDL.courbe indique qu’environ 2,5×10-8 M de LDL peut incorporer autour de 1,75×10-7
M de phtalocyanine, ce qui signifie que chaque particule peut fixer environ 7 molécules d’AlPcS2. Deux ou trois molécules fixées aux LDL ne participent donc pas au quenching du tryptophane. Cette fixation correspond donc à une association aux lipides et sera donc nommée fixation de classe L.
Figure 5.6 : Evolution de la fluorescence de la solution d’AlPcS2 (1,75×10-7 M) en fonction de la concentration en LDL, calculée à partir des spectres de la figure 5.5. La courbe correspond au meilleur ajustement des valeurs expérimentales par la l’équation (5.1). Elle donne ici KLDL = 5×107
M-1.
L’équation (5.1) peut également s’écrire sous la forme :
(
∞)
∞ + ⋅ ⋅ − − = − K [LDL] F F 1 F F 1 F F 1 0 LDL 0 0 (5.2)La représentation en double inverse 1/(F0-F) = f([LDL]) donne donc accès directement à la valeur de KLDL , en faisant le rapport de la pente obtenue et de sa valeur à l’origine (figure 5.7). La valeur obtenue confirme la validité de l’ajustement de la figure 5.6. Néanmoins, il faut noter que le type d’analyses réalisées à partir des équations (5.1) et (5.2) implique que les LDL soient en excès par rapport à la phtalocyanine. Compte tenu des résultats obtenus, il semble que nos conditions expérimentales ne remplissent pas tout à fait cette condition. Cependant, des impératifs expérimentaux (sensibilité et effet d’écran) nous ont interdit de diminuer la concentration en phtalocyanine ou d’augmenter celle des LDL. La valeur de la constante d’affinité est donc certainement sous estimée.
Le meilleur ajustement linéaire des points expérimentaux de la figure 5.7 donne accès à la valeur de la constante d’affinité globale de la phtalocyanine d’aluminium disulfonée pour les lipoprotéines de basse densité, qui est d’environ 5×107 M-1 dans du tampon phosphate à pH 7,4. Or, la même valeur a été attribuée à KP correspondant à la fixation de classe P. La fixation de classe L a donc une constante d’affinité relativement faible. Elle n’implique, cependant, que peu de
Interaction phtalocyanine - LDL
Figure 5.7 : Détermination de la constante d’affinité de AlPcS2 pour les LDL. Les intensités de fluorescence sont dérivées des spectres de la figure 5.5 et l’ajustement linéaire correspond à l’équation (5.2). La constante déduite correspond à KLDL ≅ 5×107 M-1.
L’équilibre de l’interaction LDL-AlPcS2
Les expériences réalisées à partir de l’observation des changements de fluorescence de la phtalocyanine, ainsi que de celle du tryptophane, nous ont permis de caractériser deux types de fixation. Le premier, impliquant cinq sites, conduit à un quenching de la fluorescence des résidus tryptophanes des lipoprotéines. Il s’agit de la fixation de classe P. Ce type de fixation de la phtalocyanine sur les LDL a déjà été mis en évidence par ailleurs [142]. Quelques molécules supplémentaires de phtalocyanine peuvent s’associer aux LDL sans mettre en jeu ce phénomène de FRET. Il s’agit de fixation de classe L, dans les lipides, qui correspond à la solubilisation des phtalocyanines dans la phase lipidique des LDL. Ce type de fixation a également déjà été évoqué dans la littérature [134, 142 ].
Comme pour la deutéroporphyrine, les sites de classe P sont localisés soit sur l’apoprotéine B-100 soit, plus probablement, à l’interface entre les parties protéique et lipidique des LDL. En effet, le spectre de fluorescence intrinsèque de ces lipoprotéines présente un maximum à plus de 330 nm. Cette valeur est typique de la fluorescence d’un résidu tryptophane dans un environnement fortement apolaire [136]. Cette hypothèse sera plus amplement discutée par la suite.