2.2.1 Mesures statiques
Les spectres d’absorbance ont été enregistrés avec un spectromètre UVIKON 923. Les spectres d'émission et d'excitation de fluorescence ont, eux, été enregistrés en utilisant un spectrofluorimètre SPEX (Edison, NJ) thermostaté à 20°C et, par la suite, un spectrofluorimètre AMINCO-Bowman série 2. L'enregistrement a commencé 2 minutes environ après la préparation des solutions expérimentales. Les données ont été traitées en employant le logiciel Kaleidagraph (Synergie Software, PA).
L’interaction LDL-porphyrine a pu être étudiée en suivant les changements de fluorescence de la porphyrine d’une part et, d’autre part, les modifications de la fluorescence intrinsèque des LDL induites par la fixation du colorant. La fluorescence intrinsèque des lipoprotéines leur étant conférée par leur apoprotéine, seules les molécules de porphyrines se fixant à proximité de celle-ci vont a priori pouvoir modifier sa fluorescence. Les données obtenues ainsi ont été traitées selon les méthodes de Nishida [35, 116, 117]. Les données obtenues à partir de la fluorescence de la porphyrine concernent, quant à elles, aussi bien la fixation apoprotéique que lipidique de cette dernière. Deux procédés expérimentaux ont été mis en œuvre, les variations de fluorescence du colorant étant obtenues soit en faisant varier la concentration en LDL [13, 118], soit à concentration en LDL fixe en faisant varier la quantité de porphyrine. Le logiciel Mathcad (Mathsoft, Inc., Cambridge, MA) a été employé pour des simulations numériques de l’association de la porphyrine aux LDL.
2.2.2 Cinétiques rapides et mesures résolues en temps
Les cinétiques expérimentales correspondant aux interactions étudiées ont été suivies à l’aide d'un appareil stopped-flow de Applied Photophysics (Leatherhead, UK). Cet appareil permet de mettre en contact très rapidement deux produits en solution et de suivre dans le temps leur réaction éventuelle en mesurant soit l’absorption soit la fluorescence du mélange (figure 2.1). Le mélange 1/1 (v/v) des solutions se fait en 1,2 ms : les solutions, contenues dans les seringues de travail, sont expulsées par la poussée simultanée de deux pistons actionnés par un système de gaz (azote) sous une pression de 8 bars. Cette poussée est gouvernée par un ordinateur. Le très faible diamètre des tubes et les petits volumes mis en jeu permettent la rapidité et l’homogénéité du mélange. Les solutions passent ainsi dans la chambre de mélange puis dans la cellule de détection. L’entrée du mélange dans cette dernière en expulse dans une troisième seringue la solution correspondant à l’observation précédente. Le (faible) déplacement de cette seringue d’arrêt déclenche, via l’ordinateur de commande, l’acquisition du signal dans la cellule de
détection où se trouve le mélange « frais ». Cette cellule de détection est organisée de façon à pouvoir choisir des chemins optiques de 2 ou 10 mm. Afin de limiter l’effet d’écran dû aux LDL, nous avons utilisé la configuration donnant le chemin optique le plus court.
Figure 2.1 : Principe schématique du fonctionnement d’un appareil de stopped-flow, ici en détection par fluorescence. Pour la détection par absorbance, le même montage est conservé, mais une barrette de diode est placée en sortie de la cellule de détection sur le chemin du faisceau provenant du monochromateur.
Lors de nos expériences, l’appareil était thermostaté à 20°C. La lumière d'excitation est fournie par une lampe à arc au xénon de 150 W. D’autre part, des spectres d’absorbance à temps très courts ont été enregistrés sur le même appareil grâce à une barrette de diode couvrant les longueurs d’ondes de 200 à 750 nm avec une séparation de 2,17 nm. La vitesse maximale d’enregistrement, correspondant au temps nécessaire pour l’acquisition du signal par la barrette de diode est de 2,56 ms. Les spectres sont donc enregistrés au mieux 3,76 ms après le début du mélange.
Pour les enregistrements de cinétiques rapides, la lumière d’excitation passe par un monochromateur dont les fentes ont généralement été réglées pour donner une
Matériel et méthodes
largeur de bande de 4,65 nm. La fluorescence a été collectée au dessus de 610 nm (590 nm pour les expériences sur les pK de la deutéroporphyrine) à l’aide d’un filtre passe-haut (Oriel, France) situé en sortie, devant le photomultiplicateur. Le signal de fluorescence a été observé et traité sur un poste de travail d’architecture RISC (Acorn Computers, UK) et analysé en utilisant le logiciel fourni par le fabricant. Les constantes obtenues ont ensuite été affinées par simulation sous Mathcad (Mathsoft, Inc., Cambridge, MA).
2.2.3. Expériences de saut de pH
Notre appareil de stopped-flow permet également de réaliser des expériences nécessitant deux mélanges consécutifs. Pour cela, deux seringues complémentaires sont ajoutées au montage décrit précédemment. Elles permettent le pré-mélange de deux solutions dans un tube, appelé boucle de vieillissement, dont le diamètre est légèrement plus important que les autres. La réaction correspondant à ce premier mélange a donc lieu dans cette boucle, pendant un délai choisi par l’expérimentateur et compris entre 10 ms et 1000 ms. Après ce « vieillissement », cette solution est mélangée à un volume équivalent d’une troisième solution se trouvant dans une des seringues de travail du montage précédemment décrit. La quatrième seringue, correspondant à la seconde seringue de travail de ce premier montage, contient du solvant qui est, ici, simplement utilisé pour pousser la solution de pré-mélange vers la cellule de mélange. Ces deux seringues étant, comme nous l’avons décrit pour le montage précédent, synchronisées et reliées au déclenchement de l’acquisition, la réaction correspondant à cette seconde étape est suivie selon le même principe que celui décrit dans le paragraphe précédent.
Afin d'éviter les problèmes de stabilité de la solution de porphyrine à bas pH [119, 120], le système de pré-mélange du stopped-flow a été employé pour étudier l'association de la porphyrine avec les vésicules lipidiques. Il nous a en effet permis de réaliser deux mélanges consécutifs, séparé de 10 ms. La première étape de mélange concerne une solution de porphyrine à un pH suffisamment basique pour que la porphyrine soit sous forme monomérique et une solution phosphate à pH acide (pH1), de sorte que le mélange des deux solutions donne le pH final désiré (pH2). Pour ce pré-mélange, les molarités de phosphate utilisées sont telles que la concentration finale en phosphate est de 20 mM. Puis la deuxième étape du stopped-flow mélange cette solution à une suspension de liposomes au même pH (pH2). Ce procédé, ne laissant que peu de temps à la porphyrine pour se dimériser, devrait donner un accès aux caractéristiques du monomère. Il sera plus amplement discuté dans le chapitre « Résultats 1 - Association d’une porphyrine avec les membranes».