3.4 Le traitement des données EXAFS
3.4.5 Etape 5 : L’ajustement et obtention des informations structurales
structurales
Afin d'obtenir les informations structurales Ri, Ni et σi, l'ajustement de la fonction
k3χ(k) du spectre expérimental ou issue du filtre de Fourier d'une couche particulière d'atomes (ce qui correspond au pic de la fonction k3χ(k) que l’on veut étudier, comme par exemple la première couche de la Figure 3.4-1d) est réalisé (Figure 3.4-1e). Les paramètres structuraux Ri, Ni et σi obtenus par ajustement doivent être physiques, c'est-à-dire doivent avoir une
129 signification physique. Par exemple, un ajustement donnant une distance Ri inférieure à 1,5 Å
ne peut être retenu. Dans le cas du terme de Debye-Waller σi, il n’a un sens physique que s’il
est inférieur à 10-2 Å-1. Le nombre de voisins Ni n'est, quant à lui, pas ajusté mais fixé à des
valeurs chimiquement possibles.
L'algorithme utilisé pour l'ajustement est un algorithme de Marquardt (Marquardt, 1963) permettant de minimiser une fonction de moindre carré.
L’examen de la formule EXAFS (chapitre 3.2.2 du matériel et méthodes), montre qu’il est nécessaire pour déterminer les paramètres structuraux Ri, Ni et σi de connaître les paramètres
électroniques que sont S02, fi(k), λ(k) et φij(k) ainsi que le paramètre ΔE0, qui est le décalage
en énergie entre la valeur de E0 choisie et la fonction de déphasage φij(k) choisie. Compte tenu
du nombre important de paramètres et des corrélations entre ces différents paramètres, nous avons appliqué une méthodologie développée et décrite par Lilian Jacquamet dans sa thèse (Jacquamet, 1999). Elle implique l’utilisation de composés de référence pour déterminer les paramètres structuraux.
3.4.5.1 La détermination de fi(k), φij(k) et λ(k)
Ces paramètres électroniques peuvent être obtenus expérimentalement ou théoriquement et sont déterminés pour une paire ion métallique-voisin M-X. Dans un site métallique de protéine, les voisins de l'ion métallique se limitent essentiellement aux atomes de carbone, d'azote, d'oxygène et de soufre (les atomes d'hydrogène n’étant pas détectés de façon classique en EXAFS). Comme il est ici difficile de distinguer deux atomes de la même ligne du tableau périodique, les paramètres fi(k), φij(k) et λ(k) doivent être essentiellement
déterminés pour les paires M-C/N/O et M-S.
Afin de déterminer expérimentalement ces trois paramètres, il faut disposer de composés de référence, de structure connue, et possédant un environnement du métal le plus proche possible de celui du site métallique à caractériser.
Les paramètres fi(k), φij(k) et λ(k) peuvent être aussi obtenus à partir de calculs ab initio
réalisés par le programme FEFF. Ce programme peut calculer ces paramètres pour une paire M-X isolée, et ce, quelle que soit la distance interatomique, ou les calculer dans une structure cristallographique. Ainsi, le nombre de paramètres à déterminer par ajustement est réduit de trois, puisque les paramètres η, β et γ sont déterminés automatiquement par le programme SEDEM à partir des valeurs de λ(k) calculées par FEFF.
130
C’est cette dernière méthode que nous avons choisi d’utiliser dans le cadre des études menées pendant cette thèse. Dans ce cas la formule EXAFS devient :
( )=−
∑
−(
+
( ))
i ij i k eff i iF
k
R
e
kR
k
R
R
N
S
k
k
i i(
,
)
sin
2
,
2 2 2 2 2 0φ
σ χ avec : ( , ) 2 ) , ( ) ( kR R i eff i i k f k R e F λ − = .Mais, même en utilisant les paramètres ab initio, les composés de référence restent indispensables à l’obtention des paramètres électroniques S0² et ΔE0.
Nous avons calculé les paramètres électroniques fi(k), φij(k) et λ(k) avec le programme FEFF
pour deux atomes isolés M et X (C/N/O ou S) séparés par une distance Ri, puisqu’ils sont
fonction de k mais aussi de Ri. Le choix de Ri est guidé par les composés de référence. Bien
que le choix de la valeur de Ri soit important, elle tolère un certain taux d’erreur. En effet, il
s'avère que pour une valeur de la distance Ri choisie pour le calcul, il est possible d'obtenir par
ajustement la distance cristallographique de composés de référence à une distance Ri ± 0,25 Å. Ainsi, les paramètres électroniques calculés par le programme FEFF dépendent
de Ri mais cette dépendance ne rend pas pour autant le choix de ce dernier déterminant pour
le résultat final.
3.4.5.2 La calibration et validation de S0² et ΔE0
Pour obtenir les paramètres S02 et ΔE0, nous avons utilisé des composés de structure
cristallographique connue que nous avons considérés comme « homogènes » (MXi), c'est-à-
dire avec une première sphère de coordination constituée d'un seul type d'atomes différenciables en EXAFS. Dans le composé MXi, la distance interatomique Ri et le nombre
de voisins Ni sont connus, ce qui permet alors de calculer à l’aide du programme FEFF les
paramètres fi(k), φij(k), λ(k) pour la paire M-X. L'ajustement permet alors de déterminer S02 et
ΔE0 pour une paire M-X donnée. Si Ni est fixé à sa valeur cristallographique, Ri est par contre
ajusté. En effet la distance cristallographique et la distance déterminée par EXAFS peuvent différer très légèrement de par leurs incertitudes intrinsèques. De plus, suivant les conditions expérimentales de température, les distances cristallographiques peuvent également varier. Mais en tout état de cause, l'écart entre la distance Ri déterminée par EXAFS et celle obtenue
131 3.4.5.3 La détermination de Ri, Ni et σi du site métallique à
caractériser
L’ajustement se fait par le programme SEDEM, dans un premier temps sur le filtre de Fourier du premier pic de la transformée de Fourier (Figure 3.4-1d). Ceci permet d'obtenir les paramètres structuraux Ri, Ni et σi pour chaque couche ou type d'atome. Bien entendu,
l'ajustement peut être réalisé sur le spectre total k3χ(k), mais il est souvent plus pratique de réaliser l'ajustement en premier lieu sur chaque pic de la transformée de Fourier, car le nombre de paramètres ajustés est alors moindre.
L'obtention de chaque distance par ajustement va dépendre du domaine énergétique atteint pendant l'enregistrement du spectre. En effet, la résolution en EXAFS est donnée par la relation : k R Δ ⋅ = Δ 2 π
. Pour une valeur ΔR de 0,16 Å, le Δk est égal à 10 Å-1, ce qui signifie
que deux couches séparées par moins de 0,16 Å ne seront pas distinguées en EXAFS avec un Δk usuel de 10 Å -1 pour l’étude de métalloprotéines. Il apparaît donc que, plus le domaine en
k du spectre sera étendu, meilleure sera la résolution. La nécessité d'enregistrer les spectres avec le plus grand domaine en énergie possible est donc évidente, mais cette condition impose d'améliorer la qualité des données. En biologie, compte tenu des concentrations protéiques, le temps d'accumulation est important et un faisceau extrêmement stable est donc nécessaire. L'augmentation du nombre de détecteurs (que l’on peut constater sur de nombreuses lignes consacrées à la SAX) a permis de diminuer le temps d’accumulation mais en tout état de cause, il reste toujours un compromis entre le temps d'accumulation pour obtenir un spectre avec le meilleur rapport signal sur bruit, et le temps de faisceau alloué.
En plus du caractère physique des valeurs des paramètres structuraux obtenus, on peut juger de la qualité des résultats grâce à la valeur du résiduel donné par le programme SEDEM. Il représente une estimation de la corrélation du modèle que l’on affine et des données expérimentales. Sa valeur doit être la plus faible possible.
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La spectroscopie de masse
L’étude de NikA par spectroscopie de masse a été réalisée en collaboration avec David Lemaire, du Laboratoire de Spectroscopie de Masse des Protéines (LSMP) de l’IBS.
La caractérisation par spectroscopie de masse de petites molécules a été effectuée en collaboration avec Stéphane Ménage, du Laboratoire de Chimie Biologique (CB) du CEA.