Du fait de la grande difficulté que présentait le prélèvement des cristaux ayant poussé en présence d’isopropanol, et de la faible qualité des données de diffraction (décrite dans le chapitre suivant), nous avons décidé de nous intéresser aux cristaux obtenus dans des conditions à base de PEG, qui atteignaient leur taille maximale moins vite : quinze jours au lieu de trois pour l’isopropanol. Afin d’améliorer la taille et la qualité des cristaux, nous avons testé, en suivant comme précédemment une logique de recherche systématique, les conditions suivantes :
• La variation de la nature et de la concentration des PEG : du PEG 1 000 jusqu’au PEG 20 000, plus le PEG 5 000 mme (monométhyléther) ;
• La variation de la nature et du pH des tampons ;
• La température de croissance des cristaux : 20 ou 4°C ;
• La concentration de NikR : au lieu de faire les gouttes a partir d’une protéine à 6,0 mg/mL on a utilisé une concentration de 5,0 mg/mL ;
• L’ajout d’additifs tels que : 200 mM CaCl2, 5% glycérol, 100 mM NaCl,
3% isopropanol, 10 mM CdCl2, et des détergents ;
• Ajout de nickel : NiCl2 ou NiSO4 à 200 ou 400 µM (soit respectivement 0,5 et
1 équivalent de nickel par rapport à NikR).
Deux faciès de cristaux ont alors été obtenus : des « prismes » épais (environ 0,15 x 0,15 x 0,050 mm3), mais peu nombreux et des « plaquettes » peu épaisses (environ 0,40 x 0,05 x 0,01 mm3) (Figure 1.2-1).
149
Figure 1.2-1 : Cristaux de NikR, ayant poussé dans des conditions à base de PEG. a. forme « plaquettes ».
b. forme « prisme ».
Les tests que nous avons réalisés nous ont permis de déterminer les caractéristiques suivantes pour NikR :
• La forme « plaquette » est la plus fréquente, mais il paraît très difficile de conclure quant aux paramètres favorisant un faciès par rapport à un autre ; • On constate que la nature du PEG est un paramètre primordial pour
l’apparition et la qualité des cristaux, puisque plus la taille du PEG est importante, meilleure est la qualité des cristaux. Les meilleurs résultats sont obtenus avec les PEG 20 000, 10 000, 8 000, mais avec des concentrations optimales différentes : entre 8 et 16% pour le PEG 8 000 (en dessous on observe seulement l’apparition de microcristaux). Dans le cas des PEG 5 000 mme, 10 000, et 20 000, la concentration optimale semble être autour de 8% (la nucléation devient trop importante au-delà de 12 à 14%) ;
• Le pH optimal, quel que soit le PEG, est 6,5 (MES 0,1 M), ou 7 (Tris 0,1 M) ; • Des cristaux sont obtenus à 20°C, par contre à 4°C la protéine précipite ;
• L’ajout de certains additifs améliore la qualité des cristaux : 100 mM de NaCl à faible concentration de PEG 5 000 mme ; et surtout 20 mM de βOG (n-octyl- β-D-glucopyranoside) avec 10 et 15% de PEG 5 000 mme, qui augmentent l’épaisseur des cristaux. Mais leur qualité de diffraction ne s’est pas révélée suffisante ;
• L’ajout de nickel ne semble pas modifier la croissance cristalline : on obtient des cristaux des deux faciès en présence et en absence des deux sels de nickel testés.
a.
500 μmb.
150
Il est à noter que tous ces résultats ont été obtenus avec la protéine NikR contenant 2 mM d’EDTA. Si l’on dialyse la protéine pour le supprimer, et que l’on essaye de la cristalliser, on ne constate pas de différence significative avec les résultats décrits plus haut. Par contre, en rajoutant du nickel à cette protéine dialysée, nous n’avons pas pu réobtenir de cristaux. Il se peut qu’un changement de conformation de la protéine perturbe l’empilement cristallin, et ainsi empêche l’apparition de cristaux. Mais ces résultats seraient à confirmer, puisque peu de tests ont été menés.
2
L’enregistrement et traitement des jeux de diffraction
2.1
Les cristaux de NikR obtenus en utilisant l’isopropanol
comme précipitant
Le premier cristal dont nous avons obtenu les images de diffraction provient de la goutte à base d’isopropanol du screen Jancarik. Il a été congelé avec une solution cryoprotectrice, une concentration plus élevée en précipitant que la solution réservoir, et 30% de glycérol comme agent cryoprotectant, et a été enregistré sur la ligne ID13 (ligne microfocus) de l’ESRF. Nous avons enregistré 180° (en effectuant des pas de 1°), mais la congélation avait endommagé le cristal, comme le montrait son faciès dégradé et sa mosaïcité très importante. Le traitement des données n’a permis d’obtenir que les paramètres de la maille : le cristal de NikR appartenait donc au groupe d’espace monoclinique P2, avec a = 44,3 Å ; b = 122,0 Å ; c = 51,4 Å ; α = 90,0° ; β = 122,0° ; γ = 90,0°.
Le glycérol pouvant être à l’origine de la dégradation du cristal, nous avons par la suite testé un ensemble de cryoprotectants comme par exemple le sucrose, l’éthylène glycol, le PEG 400, les huiles… La plupart ne convenaient pas car :
• Soit ils ne cryoprotégaient pas les cristaux ;
• Soit il y avait une séparation de phase avec l’isopropanol ; • Ou soit le cristal s’abîmait.
Les seuls qui ont semblé remplir toutes les conditions requises pour un cryoprotectant, étaient le PEG 400 à 30% et l’huile de silicone. Ils nous ont ainsi permis de congeler des cristaux et de les tester sur la ligne de l’ESRF ID14eh2. Malheureusement, aucun des trois jeux de données enregistrées (sur des cristaux d’environ 300 x 100 μm2 qui diffractaient entre 4,5 et
151 déterminer une maille prédisant les taches de diffraction de ce cristal de NikR, du fait de la très mauvaise qualité des données de diffraction : ils se sont révélés présenter une grande mosaïcité et être polycristallins.
2.2
Les cristaux de NikR obtenus en utilisant les PEG comme
précipitant
2.2.1
Les cristaux cryoprotégés dans l’azote liquide
Afin de pouvoir être testés en diffraction, les cristaux de NikR ont été cryoprotégés par remplacement progressif de la solution de cristallisation par une solution composée de : 3% de PEG de plus que la composition de la solution de cristallisation (afin de stabiliser les cristaux), 20% de PEG 400 (le cryoprotectant), le même tampon et les mêmes additifs que la solution mère.
Plusieurs cristaux ont été testés, ce qui nous a permis de constater que la forme « prisme » était souvent très fortement mosaïque et posait des problèmes lors de la cryoprotection (il leur arrivait de se casser), et que la forme « plaquette », présentait une meilleure qualité de diffraction, mais était très sensible aux rayons X. Dans les deux cas, on a constaté une chute de l’intensité de diffraction lorsque la résolution dépasse 3 Å. Mais différents jeux de données ont tout de même pu être enregistrés.
Un jeu de données de diffraction a pu être enregistré sur la ligne de lumière de l’ESRF ID14eh1 à partir d’une « plaquette » relativement épaisse (par rapport aux autres cristaux obtenus), de 0,50 x 0,04 x 0,01 mm3. Elle est apparue dans les conditions de cristallisation suivantes :
[NikR] = 6 mg/mL; 14% de PEG 8 000 ; 0,1 M MES pH 6,5 ; 20°C en goutte suspendue.
Après traitement des données de diffraction (Tableau 2.2-1), ce cristal s’est révélé du groupe d’espace monoclinique P2, mais avec un axe pseudo 21, puisque l'on observe de faibles taches
de diffraction là où des extinctions systématiques liées à l'axe hélicoïdal 21 correspondant à k
= 2n + 1 devraient exister. Bien que le jeu de données soit relativement mosaïque (calculé avec XDS), il donne des statistiques de qualité raisonnable (Tableau 2.2-1).
152
Ligne de lumière de l’ESRF ID14eh1
Longueur d’onde 0,934 Å
Groupe d’espace P2
Paramètres de maille a = 46,8 Å ; b = 117,2 Å ; c = 49,3 Å ;
α = 90° ; β = 116,6° ; γ = 90° Nombre de molécules par unité
asymétrique 4
Mosaïcité 0,42°
Résolution 55,0–3,0 Å (3,2–3,0 Å)
Complétude 95,7% (90,3%)
I/σ(I) 8,6 (3,4)
Nombre total de réflexions mesurées 34 316 (5 737)
Redondance 3,6 (3,6)
RSYM 7,7% (24,3%)
Tableau 2.2-1 : Statistiques des données de diffraction d'un jeu natif de la protéine NikR congelée dans l’azote liquide. Les valeurs entre parenthèses correspondent à la dernière tranche de résolution.
2.2.2
Les cristaux cryoprotégés dans le propane liquide
L’un des principaux problèmes que nous avions avec les cristaux de NikR, était leur grande mosaïcité et la relative mauvaise qualité de leurs données de diffraction. Puisque tous les essais d’amélioration de la qualité des cristaux n’ont pas permis de s’affranchir de ce problème, nous avons émis l’hypothèse qu’il devait provenir de l’étape de congélation des cristaux. Pourtant nous avions déjà testé plusieurs cryoprotectants, et aucun n’était apparu comme meilleur que le PEG 400. Cela ne nous a donc laissé plus qu’une seule possibilité d’amélioration de la qualité de diffraction : remplacer la congélation à l’azote liquide par une congélation au propane liquide (chapitre 2.3.1.1 du matériel et méthode).
C’est ce que nous avons réalisé en utilisant la solution suivante comme cryoprotectant : 3% de PEG supplémentaire, par rapport à la composition de la solution de cristallisation, 30% de PEG 400, le même tampon et les mêmes additifs que la solution mère. Les cristaux avaient la même limite de résolution que dans le cas d’une congélation à l’azote, mais par contre ils sont apparus peu mosaïques. Ceci est corrélé à une amélioration des paramètres statistiques reflétant la qualité de la diffraction des cristaux.
153 Dans ce cas, le meilleur jeu de données de diffraction natif que nous ayons obtenu provenait d’un cristal ayant poussé dans les conditions suivantes :
[NikR] = 6 mg/mL ; PEG 8 000 14% ; MES 0,1 M pH 6,5 ;
NiCl2 400 µM (1 équivalent Ni / NikR) ;
20°C en goutte suspendue.
Il s’agissait d’un cristal possédant un faciès de « plaquette ». Il est apparu très peu mosaïque et les données de diffraction d’une qualité meilleure (Tableau 2.2-2) que dans le cas des cristaux congelés dans l’azote.
Ligne de lumière de l’ESRF ID14eh4
Longueur d’onde 0,9393
Groupe d’espace P21
Paramètres de maille a = 49,9 Å ; b = 116,5 Å ; c = 89,9 Å ;
α = 90° ; β = 115,1° ; γ = 90° Nombre de molécules par unité
asymétrique 8
Mosaïcité 0,24°
Résolution 30,0–2,9 Å (3,0–2,9 Å)
Complétude 98,0% (92,1%)
I/σ(I) 13,5 (4,1)
Nombre total de réflexions mesurées 82 168 (7 419)
Redondance 3.8 (3.8)
RSYM 6,0% (29,5%)
Tableau 2.2-2 : Statistiques des données de diffraction d'un jeu natif de la protéine NikR congelée dans le propane liquide. Les valeurs entre parenthèses correspondent à la dernière tranche de résolution.