et le “spot” inject´e dans le canal de s´eparation se d´eforme. L’utilisation de canaux fins et longs, ainsi que le contrˆole des volumes d´epos´es dans chaque r´eservoir permet de supprimer cet effet.
La pr´esence d’une mobilit´e ´electroosmotique diff´erente entre les parois du canal peut ´egalement induire des gradients de vitesse. Ainsi lorsque le canal est referm´e par un wafer en verre, la mobilit´e des parois ´evolue diff´eremment ce qui peut engendrer de tels gradients et donc diminuer la r´esolution [134]. Le protocole incluant un conditionnement `a la soude a permis de supprimer presque totalement cet effet.
Le ph´enom`ene d’adsorption est `a l’origine de l’´elargissement des pics de prot´eines. L’utili- sation de SDS a fortement diminu´e ce ph´enom`ene sans pour autant le supprimer. La mise en œuvre de traitements de surfaces permanents sera sans doute indispensable si une r´esolution de s´eparation plus importante est n´ecessaire.
Il est int´eressant de noter que la mobilit´e ´electroosmotique ´evolue l´eg`erement avec le temps. Cette ´evolution ´etant faible `a l’´echelle des exp´eriences qui duraient g´en´eralement moins d’une heure, nous n’avons pas proc´ed´e `a une ´etude exhaustive de cet effet, probablement due `a l’adsorption d’ions de la solution [140].
2.4.2 Rˆole du champ ´electrique
Comme attendu, l’augmentation du champ ´electrique accroˆıt le nombre de plateaux du canal de s´eparation, ce qui am´eliore sa capacit´e s´eparative. Les mesures de vitesse en fonction du champ ont montr´e que le syst`eme restait dans le r´egime lin´eaire sur l’ensemble de la gamme disponible par le g´en´erateur de haute tension. Le champ maximal que nous avons utilis´e ´etait de 700 V/cm dans la branche de s´eparation, ce qui a permis d’obtenir un nombre de plateaux de 50 000 pour un temps de s´eparation de l’ordre de la minute.
2.4.3 Augmentation de la longueur du canal
Le module de s´eparation n’a pas pour but de s´eparer toutes les prot´eines pr´esentes dans un ´echantillon mais uniquement de le fractionner pour r´eduire le nombre de prot´eines pr´e- sentes pour chaque digestion. N´eanmoins si une meilleur r´esolution devient n´ecessaire, un allongement du canal de s´eparation permettra d’obtenir la r´esolution recherch´ee. Dans ce cas, la pr´esence de tournants sera in´evitable. Ces tournants peuvent diminuer la r´esolution de la s´eparation en augmentant la dispersion hydrodynamique [120, 141]. Mais il a ´et´e montr´e nu- m´eriquement que l’utilisation d’angles particuliers associ´es `a des motifs de charges de surfaces pouvait supprimer cet effet [142]. Un r´etr´ecissement du canal au niveau des tournants peut ´egalement diminuer la dispersion [107].
2.5
S´election d’un spot de prot´eine et liaison avec le module
de digestion
La liaison entre le module de s´eparation et le module de digestion est r´ealis´ee `a l’aide d’un jeu de vannes in-situ. Le protocole suivi est d´ecrit par la figure suivante (Fig. 2.16).
Les vannes transverses (1) et (2) sont ouvertes pendant la phase de s´eparation. Pour s´electionner les prot´eines de mˆeme mobilit´e du spot (B), les potentiels ´electriques sont mis `
a zero lorsque le spot (B) passe entre les vannes (1) et (2) et ces derni`eres se ferment. La double vanne (3) s’ouvre alors pour connecter la portion du canal de s´eparation au module de
128 Chapitre 2. Le module de s´eparation 1 2 A B 3 1 2 C
Fig. 2.16 – Etapes n´´ ecessaires `a l’injection d’un spot de prot´eines dans le module de s´eparation.
digestion. Ce protocole permet de capturer un volume de 2 nL d´efini par l’´ecartement entre les vannes lat´erales.
Il est ainsi possible de pr´elever un type de prot´eine pour proc´eder `a sa digestion enzy- matique. Dans le cas d’une analyse s´equentielle, il suffit de rincer le canal de s´eparation et le module de digestion avant de r´eit´erer la protocole avec un temps de s´eparation diff´erent. Le volume d’´echantillon utilis´e pour chaque analyse ´etant tr´es petit devant le volume d´epos´e dans le r´eservoir (2 nL 20 µL), il est possible de faire un grand nombre d’analyses `a la suite. Dans le cas o`u la prot´eine d’int´erˆet est rare, il suffit de proc´eder `a N cycles de s´epara- tion/extraction dans les mˆemes conditions, sans proc´eder `a la phase de digestion. Le r´eacteur enzymatique contient alors N × 2 nL de prot´eine qui seront dig´er´ees en mˆeme temps, ce qui permet d’augmenter la sensibilit´e de l’analyze des peptides par spectrom´etrie de masse.
La figure 2.17 pr´esente les trois ´etapes de l’extraction d’un spot de fluoresc´eine. Nous pouvons remarquer la d´eformation du spot de fluoresc´eine lorsque la pompe p´eristaltique est activ´ee, due `a des gradients de vitesse importants au sein du microcanal. Ces gradients de vitesse seront d’ailleurs le moteur du m´elange au sein du module de digestion.
(a) (b) (c)
Fig. 2.17 – Visualisation de 3 ´etapes du pi´egeage d’un spot de fluoresc´eine. Le spot de fluoresc´eine est captur´e par les vannes (1) et (2), avant d’ˆetre envoy´e dans le module de digestion. On observe sur la troisi`eme photographie (c) l’action des gradients de vitesse qui d´eforment consid´erablement le spot initial.