Analyses de la digestion enzymatique

Spectre de digestion de la Lysozyme

Le spectrogramme des peptides issus de la digestion d’une solution de lysozyme dans le r´eacteur enzymatique est donn´e ci-dessous (Fig. 3.5).

lysozyme

lysozyme trypsine

lysozyme

134 Chapitre 3. Le module de digestion enzymatique

Nous pouvons observer la pr´esence de plusieurs pics caract´eristiques de la lysozyme ainsi que ceux correspondant `a l’auto-digestion de la trypsine. Le pourcentage de recouvrement est de 57% ce qui permet une identification fiable `a 100% d’apr`es le logiciel utilis´e.

Le r´eacteur enzymatique de 80 nL permet donc de r´ealiser la digestion d’une prot´eine en une vingtaine de minutes et d’en r´ecup´erer les peptides, `a partir d’un ´echantillon de 2 nL. Cette rapidit´e est `a mettre aux cr´edits de la minuaturisation et de la technique de m´elange, qui augmentent les probabilit´es de rencontre entre prot´eine et enzyme.

Exemples de contamination

Nous avons ´et´e confront´e `a plusieurs types de contamination au cours de la mise au point du syst`eme. Ces contaminations ´etaient le plus souvent dues `a des erreurs de manipulations. Ainsi la pr´esence de k´eratine, une prot´eine de l’´epiderme, a ´et´e d´etect´ee dans des microsys- t`emes stock´es sans protection sur une paillasse. Paradoxalement, cela a permis de mettre en ´evidence l’efficacit´e du protocole de digestion et la grande sensibilit´e de l’analyse par spectro- m´etrie de masse.

Une contamination plus subtile a ´egalement ´et´e mise en ´evidence dans les premiers circuits. En analysant par spectrom´etrie une solution d’eau d´esionis´ee qui a circul´e dans le r´eacteur enzymatique pendant une vingtaine de minutes, nous avons obtenu le spectrogramme ci- dessous (Fig. 3.6. 649.0 1319.4 1989.8 2660.2 3330.6 4001.0 Mass (m/z) 0 8260 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % I n t e n s it y Voyager Spec #1[BP = 701.6, 8260] 701.6342 679.6429 887.5648

Fig. 3.6 –Spectrogramme de masse d’une solution ayant travers´e le m´elangeur. On observe la pr´esence de pics parasites, vraissemblament dus au r´eticulant du PDMS, qui ´ecrasent l’ensemble du spectre.

Les r´esultats montrent la pr´esence de deux pics caract´eristiques qui ´ecrasent tout le spectre. Cette contamination ´etait davantage perceptible dans les cas o`u le syst`eme microfluidique a ´et´e coll´e en utilisant une diff´erence de concentration du r´eticulant entre les deux couches de PDMS. Il est vraisemblable que l’exc`es de r´eticulant migre `a travers le PDMS jusqu’`a atteindre le circuit microfluidique. Dans la suite du projet, nous avons bien entendu r´ealis´e tous les collages `a l’aide d’un nettoyage au plasma. Il est ´egalement n´ecessaire de v´erifier qu’aucune des solutions utilis´ees n’attaque les divers r´ecipients et seringues o`u elles sont stock´ees. Dans le cas contraire on peut observer des pics parasites r´eguli`erement espac´es, typique d’une contamination par un polym`ere (Fig. 3.7).

3.4. Conclusion 135 646.0 764.4 882.8 1001.2 1119.6 1238.0 Mass (m/z) 0 1.0E+4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % I n te n s it y Voyager Spec #1[BP = 680.2, 10008] 680.1986 685.2139 729.2881 773.3640 681.2007 817.4347 686.2167 730.2947 861.5004 669.2121 774.3691 702.2238 757.3537 818.4434 905.5766 657.1759 801.4200 862.5137 703.2238 745.3048 906.5795 949.6500 998.7289 658.1502 789.3753 863.5374 704.2189

Fig. 3.7 – Spectrogramme typique d’une contamination par un polym`ere dissous.

3.4

Conclusion

Du point de vue fluidique, le syst`eme a montr´e son efficacit´e et sa robustesse pour pr´elever 2 nL d’un ´echantillon dans le canal de s´eparation, le m´elanger en quelques dizaines de secondes dans le r´eacteur puis de r´ecup´erer le r´esultat de la digestion.

Du point de vue biologique, le r´eacteur de enzymatique permet de r´ealiser des digestions rapidement, une vingtaine de minutes. La sensibilit´e du syst`eme d’analyse n´ecessite de prendre en compte plusieurs sources de contamination externes au microsyst`eme.

Chapitre 4

Bilan et perspectives du projet

prot´eomique

Nous avons montr´e au cours de ce projet la possibilit´e de r´ealiser plusieurs fonctions compl´ementaires au sein d’un mˆeme microsyst`eme. L’originalit´e principale de ce travail r´eside dans l’utilisation conjointe de deux modes de contrˆole des fluides, l’´electroosmose et l’actuation pneumatique int´egr´ee.

4.1

Le module de s´eparation

Le bon contrˆole des ´ecoulements au sein de l’´etage de s´eparation a permis de s´eparer des m´elanges de prot´eines et de fluoresc´eine de mani`ere reproductible en quelques dizaines de secondes. Le gain de temps vis-`a-vis d’une s´eparation ´electrophor´etique sur gel est donc consid´erable. Bien entendu la qualit´e de s´eparation n’est pas encore comparable mais la simple augmentation de la longueur du canal de s´eparation permettra d’am´eliorer rapidement cet aspect. Il est important de noter que l’objectif de ce module n’est pas de s´eparer toutes les prot´eines du m´elange mais de fractionner le m´elange initial, pouvant contenir quelques centaines de prot´eines, en une dizaine d’´echantillons contenant chacun quelques dizaines de prot´eines. Cette ´etape interm´ediaire est indispensable pour identifier les peptides issus de la digestion aux prot´eines initiales d’une mani`ere non ambigue.

L’utilisation du PDMS, indispensable pour r´ealiser le syst`eme d’actuation, a n´ecessit´e d’´etudier le probl`eme de l’interaction entre les prot´eines et le PDMS. Plusieurs traitements de surface ont donc ´et´e test´es pour limiter l’adsorption des prot´eines `a la surface du PDMS. Les plus efficaces se sont r´ev´el´es ˆetre l’utilisation des tensioactifs, principalement du SDS, et de l’ac´etonitrile. Bien que l’utilisation de tensioactif semblait pr´ejudiciable `a la digestion enzy- matique, nous avons montr´e que la pr´esence de SDS dans la solution n’etait pas incompatible avec le protocole biologique.