Effets sur le système nerveux central

6.4.3.1 Présentation du système nerveux central

Le système nerveux central (SNC) commande et contrôle l’ensemble du corps. Son rôle est de recevoir, enregistrer, interpréter les signaux qui parviennent de la périphérie et ceux d'origine internes, et ainsi organiser la réponse appropriée. Le SNC est composé i) de l’encéphale comprenant le cerveau, le tronc cérébral et le cervelet, ii) de la moelle épinière et iii) des nerfs optiques. L'encéphale constitue l'organe principal du système nerveux central.

Situé à l'intérieur de la boîte crânienne, il est responsable de l'envoi des influx nerveux (voir définition ci-dessous) moteurs, du traitement des données transmises par les influx nerveux sensitifs ou sensoriels (audition, odorat, ...), et des fonctions supérieures comme le langage et les processus cognitifs complexes (mémoire, attention, planification, raisonnement, …).

Le cerveau est constitué de 2 hémisphères (droit et gauche) qui communiquent par un faisceau de fibres, le corps calleux. Il est divisé en 4 lobes (cf. Figure 35) :

 le lobe frontal (avant) est impliqué dans l’initiation et la coordination des mouvements, dans les tâches cognitives supérieures comme la résolution de problèmes, la pensée, la planification, bien d’autres aspects de la personnalité et de la formation des émotions ;

 le lobe pariétal (milieu) intervient dans les processus sensoriels, l’attention et le langage ;

 le lobe temporal (milieu) joue un rôle dans l’encodage des informations auditives et dans l’intégration des informations provenant des autres modalités sensorielles. Il intervient dans la mémoire grâce à l’hippocampe, et dans la mémoire émotionnelle grâce à l’amygdale ;

 le lobe occipital (arrière) a un rôle dans l’information visuelle y compris dans la reconnaissance des formes et des couleurs.

Parmi les structures du cerveau étudiées dans la littérature, l’hippocampe est la plus représentée pour son implication dans la mémoire chez l’Homme ou l’animal. De plus, cette structure est située dans le lobe temporal, au niveau des 2 oreilles et donc proche d’un téléphone mobile au cours d’une conversation téléphonique.

Les éléments cellulaires composant le SNC sont le neurone (composé d’un corps cellulaire ou soma, de dendrites, d’un axone, et de synapses, cf. Figure 35) et les cellules gliales (astrocytes, oligodendrocytes, microglie et épendyme). La substance grise est formée par les cellules et la substance blanche par les fibres (axones des neurones).

 Les neurones sont des cellules spécialisées dans la réception, l’intégration et la transmission d’informations, ils sont intégrés dans des réseaux multiples ordonnés et hiérarchisés, chargés de recevoir, de transmettre un signal ou de coordonner une fonction complexe. La transmission des informations (influx nerveux) entre les neurones ou entre un neurone et un effecteur (muscle, cellule sécrétrice d’une glande) se fait au niveau des synapses, zones de contacts spécialisées assurant le transfert des signaux entre les cellules. Les synapses sont soit de nature électrique (présentes dans de nombreux tissus), soit, le plus souvent, de nature chimique (neurotransmetteurs, uniquement dans le système nerveux). Ce sont les neurones qui véhiculent l’influx nerveux, c’est-à-dire le potentiel électrique se déplaçant sur l’axone après stimulation du corps cellulaire du neurone. Le potentiel d’action est une variation transitoire du potentiel membranaire déclenchée suite à une stimulation. Celle-ci peut

provenir d’un autre neurone, ou de la stimulation d’un récepteur sensitif (ex : à la surface de l’organisme [peau], dans l’organisme [organes]). Le potentiel d’action se fait en différentes étapes : la dépolarisation, la repolarisation et l’hyperpolarisation (cf.

Figure 35).

Les propriétés électriques des neurones sont à la base des études électrophysiologiques in vivo ou in vitro chez l’animal ou cliniques chez l’humain (électroencéphalographie ou EEG, exploration de l’activité électrique cérébrale de veille et de sommeil, potentiels évoqués somato-sensoriels, moteurs ou cognitifs).

 Les cellules gliales constituent le tissu de soutien du système nerveux, assurent le lien avec les vaisseaux sanguins et apportent les nutriments essentiels au fonctionnement métabolique du SNC. Ces cellules, contrairement aux neurones, peuvent se multiplier, voire proliférer et devenir cancéreuses. Les astrocytes sont les plus nombreux et représentent le tissu de soutien, assurent le support métabolique et la synthèse des constituants du système nerveux, ils sont aussi les constituants de la barrière hématoencéphalique. Les olygodendrocytes élaborent la myéline qui entoure les axones, et les cellules microgliales sont des macrophages avec des propriétés de phagocytose et qui assurent le rôle de défense immunitaire.

Les astrocytes et la microglie, ainsi que leurs marqueurs spécifiques (ex : GFAP, OX-42, ED1, cytokines…), sont étudiés chez l’animal pour la recherche d’une inflammation en réponse à divers stimuli de l’environnement, dont les radiofréquences.

Figure 35 : Présentation du système nerveux central (à gauche), d’un neurone (au milieu) et d’un potentiel d’action (à droite)

6.4.3.2 Analyse du corpus bibliographique

Sept publications ont été analysées et évaluées de qualité suffisante pour être intégrées à l’évaluation du niveau de preuve. Une étude a été réalisée chez l’humain (Partyla et al., 2017) et 6 études in vitro sur plusieurs modèles de neurones en culture (Haas et al., 2016a, 2016b, 2017; Romaneko et al., 2014, 2019 : Samsonov et Popov, 2013). L’étude de Partyla et al. a concerné les effets anti-douleurs. Les études in vitro se sont focalisées sur la réponse électrophysiologique, la croissance des neurites, le métabolisme de la dopamine et les mécanismes possibles des effets potentiels sur la douleur (nociception/anti-nociception ou analgésique/antalgiques) des radiofréquences. Les effets anti-nociceptifs ou analgésiques des radiofréquences dans la gamme des ondes dites « millimétriques » sont investigués depuis de

dendrites

soma (noyau) axone Cervelet

Tronc cérébral

Lobe pariétal

Lobe temporal

Lobe frontal

Lobe occipital

synapses

nombreuses années, tant chez l’Homme que chez l’animal, avec des résultats contradictoires.

En effet, les fréquences dans la gamme 40 - 60 GHz (voire 30-70 GHz), à des densités de puissance de 1 à 10 mW/cm², sont utilisées en thérapeutique depuis plus de 30 ans, notamment en Russie pour leurs propriétés analgésiques revendiquées (ex : maux de tête, douleurs articulaires, douleurs post-opératoires et douleurs neuropathiques¹⁴¹ (Usichenko et al., 2006)). Ceci explique que l’essentiel des études se sont focalisées sur ces aspects pour en comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au niveau cérébral. Trois études n’ont pas été retenues (Shiina et al.,2014 ; Degoyan et al., 2012 ; Sivachenko et al., 2016) et sont décrites succinctement.

Étude chez l’Homme

L’étude chez l’Homme de Partyla et al. (2017) s’est intéressée aux effets hypoalgésiques (anti-douleur) des radiofréquences. Elle a porté sur une cohorte de 20 jeunes hommes volontaires, sains. Ceux-ci ont été exposés à un signal radiofréquence (42,24 GHz, intensité

< 17,2 mW/cm², condition appelée « générateur-RF ») à l’aide d’un générateur et d’une antenne située à moins de 1 cm de la peau, au niveau du sternum. Les sujets ont subi 4 séances de 30 min à 24 h d’intervalle. Ils ont également été exposés à deux situations témoins : placébo d’une part (appelée « condition générateur - sans RF ») et « bruit » d’autre part (condition appelée « générateur, 50-70 Hz »), cette dernière correspondant au bruit émis par le générateur. Une condition basale a également été incluse (sans exposition aux radiofréquences, sans générateur). L’ensemble des expositions ont été réalisées selon un protocole randomisé, en double aveugle et croisées. Le seuil de douleur a été évalué par le test CPT (cold pressure test) : le sujet place sa main dans l’eau glacée (1°C) et le temps de latence jusqu’au ressenti de douleur est mesuré. Le test CPT a été réalisé 6 fois (à 24 h d’intervalle minimum). Les autres paramètres évalués ont été la pression artérielle, le rythme cardiaque, l’incidence d’une sensation subjective (ex : paresthésie) pendant l’exposition. Les résultats montrent que si certains paramètres, comme le seuil de douleur, la latence de sensation douloureuse (différence entre tolérance à la douleur et seuil douloureux en secondes) ou encore la pression diastolique, augmentent significativement avec l’exposition aux radiofréquences par rapport aux conditions basale et « bruit », aucune différence n’est observée par rapport à la condition placébo. Ces résultats ne valident donc pas l’hypothèse initiale des auteurs d’un effet hypoalgésique des radiofréquences, en tout cas dans les conditions de l’étude. Cette étude est de bonne qualité, une légère réserve est à émettre sur le choix de certains tests statistiques.

Études in vitro

Les 2 études de Romanenko et al. se sont intéressées à l’activité électrique neuronale en réponse à une exposition aux radiofréquences. En 2014, Romanenko et al. ont mesuré les effets physiologiques d’un signal radiofréquence (60 GHz, signal continu, densité de

141 Plusieurs types de maladies peuvent être à l’origine d’une douleur neuropathique : maladies neurologiques (Parkinson, sclérose en plaques, accident vasculaire cérébral), maladies métaboliques (diabète), maladies infectieuses (zona), sida ou cancer, et chimiothérapies. Il en résulte des lésions du système nerveux central ou périphérique dans des zones intervenant dans la transmission et le contrôle de la douleur.

Les douleurs neuropathiques possèdent deux composantes : une douleur permanente de type brûlure ou étau à laquelle peuvent s’ajouter des épisodes douloureux transitoires. Ces derniers, appelés accès paroxystiques douloureux, se caractérisent par une intensification spontanée et de courte durée de la douleur pouvant être aiguë, voire insupportable, avec sensation de décharge électrique ou coup de poignard. D’autres sensations, non douloureuses, transitoires, peuvent aussi être perçues (fourmillements, engourdissements, picotements). Ce type de douleur résiste souvent aux traitements conventionnels de la douleur (antalgiques).

puissance = 1, 2 et 4 mW/cm²) pendant 1 min sur des neurones de ganglion de sangsue en culture. L’objectif était l’identification, la quantification et la visualisation de la forme des potentiels d’action sous l’effet des radiofréquences, en comparaison avec ceux induits par une augmentation similaire et progressive de la température du milieu d’incubation (0,4 °C/s, soit 2,4 °C/min). La température des ganglions a été enregistrée à l’aide d’un système par fibre optique et spectrophotométrie (résolution 0,05 °C, temps de réponse < 100 ms), et celle du milieu par une sonde Thermistor, (précision 0,01 °C). Les potentiels d’action au repos de chaque cellule étudiée ont été enregistrés au moyen d’une microélectrode intracellulaire. Les résultats montrent que pour les 2 conditions (exposition aux radiofréquences et température), une augmentation dose-dépendante et similaire de l’hyperpolarisation des neurones (le potentiel de membrane devient plus négatif [efflux d’ions K⁺ ou afflux d’ions Cl^-]) et une baisse de l’amplitude des potentiels d’action ont été observées. Cependant, le rétrécissement de la forme du potentiel d’action (phases ascendante et descendante) est 5 fois plus marqué avec l’exposition aux radiofréquences (4 mW/cm²) comparativement à celui observé après l’augmentation de 0,6 °C de la température. De plus, le taux de décharge des neurones est supprimé par les radiofréquences aux 3 densités de puissance (persistant pendant la durée de l’exposition pour 1 mW/cm², transitoire pour 2 et 4 mW/cm²), alors qu’il augmente de manière dose-dépendante avec l’augmentation graduelle de la température. Ces effets directs des radiofréquences disparaissent 5 s après la fin de l’exposition. Les auteurs émettent l’hypothèse selon laquelle le mécanisme associé aux effets non thermiques des radiofréquences impliquerait une interaction spécifique de l’énergie des ondes avec la membrane du neurone. Les auteurs proposent que l’effet inhibiteur des radiofréquences pourrait être utilisé pour supprimer (moduler à la baisse) la douleur comme déjà montré chez l’animal et l’Homme (ex : Radiesky et al., 2008 ; Usichenko et al., 2006). Cette étude est de grande qualité, présentant de nombreux résultats, avec une analyse statistique solide.

La 2^de étude réalisée par cette équipe, dans la suite des travaux de 2014, s’est focalisée sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes cellulaires traitant les signaux douloureux (Romanenko et al., 2019). Pour cela, les auteurs ont étudié la réponse de neurones sensoriels primaires ou nocicepteurs (NI) issus de ganglions de la sangsue médicinale : ceux-ci sont actifs lorsqu’ils sont exposés à un stimulus douloureux (pression, agent chimique ou osmotique, changements de température). La sensibilité à la température est attribuée à la présence d’un récepteur, le transient receptor potential vanilloid-1 (TRPV1)-like capsain receptor activé par des températures de 42 à 45°C, mais ce récepteur est aussi sensible à des variations de l’osmolarité. Les enregistrements électrophysiologiques ont été réalisés à l’aide d’une micro-électrode de verre positionnée dans le neurone choisi, sous contrôle au microscope. La préparation a été exposée à un signal radiofréquences (60 GHz, signal continu, densité de puissance 170 mW/cm²) pendant 3 à 5 min. Un témoin de température a été systématiquement inclus. La 1^ère expérience a montré que l’exposition aux radiofréquences modifie le seuil d’activation des neurones (déclenchement des potentiels d’action ou PA) qui est d'environ 50 % inférieur à celui observé chez le témoin température. L’exposition ne modifie ni l’excitabilité des neurones NI, ni la résistance membranaire, ni les conductances voltage-dépendantes. De plus, la réponse aux radiofréquences des neurones NI est annulée en présence d’un antagoniste des récepteurs TRPV1, montrant que ces effets pourraient résulter de l’activation de ces récepteurs. Afin de tester le rôle possible de changement de l’osmolarité plutôt que de celui de la température - les TRPV1 étant sensibles à ces deux paramètres - l’enregistrement d’un autre type de neurones (sensibles à des stimulations mécaniques), les neurones N-médial., Nm) ne possédant pas de récepteurs TRPV1 mais des

récepteurs TRPV4 (sensibles à l’osmolarité) a été réalisé. Les auteurs ne montrent aucune altération par les radiofréquences de l’activité des neurones Nm. Ces données confirment que la sensibilité des neurones NI serait due à l’activation des TRPV1. Ce récepteur étant sensible aux teneurs en calcium extracellulaire, l’expérience suivante a consisté à tester les effets des radiofréquences sur les neurones NI en présence d’une teneur élevée en calcium : celle-ci annule les effets des radiofréquences sur le seuil de déclenchement des potentiels d’action.

Enfin, dans la dernière expérience, un modèle in silico, soit une modélisation et des simulations informatiques, a été développé. Il a permis de confirmer les données expérimentales et de proposer que parmi les mécanismes potentiels d’effets des radiofréquences, le plus efficace est la sensibilisation des TRPV1 via leur thermo- et osmo-sensibilité. Les auteurs concluent sur l’intérêt de l’utilisation de ce type de signaux radiofréquences dans le cadre de la neurostimulation et du traitement des douleurs chroniques. Cette étude de bonne qualité, bien construite et rigoureuse, propose un mécanisme potentiel d’effets non thermiques des radiofréquences sur des nocicepteurs.

La publication de Haas et al. (2016a) concerne également la douleur et ses mécanismes, avec l’étude de l’expression de protéines spécifiques (TRPV1 et TRPV2), des récepteurs-canaux cationiques voltage-dépendants (voir Romanenko et al., 2019 ci-dessus) et P2X3, un purino-récepteur fonctionnant aussi comme un canal cationique. Pour cela, les auteurs ont étudié les effets des radiofréquences (60,4 GHz, signal continu, 10 mW/cm²) pendant 24 h sur des cellules PC12 (clone NS-1) en culture. Les cellules PC12 dérivent de tumeurs des glandes surrénales de rat. Elles se différencient et présentent un phénotype neuronal en présence du facteur de croissance NGF (Nerve Growth Factor) et sont alors considérées comme un modèle de neurones en culture. L’expression de la protéine de choc thermique HSP70 a été mesurée, comme marqueur de stress cellulaire. Deux groupes contrôles ont été inclus : sham (sans exposition aux radiofréquences, 37°C) et température (heat control ou HC, 38,6 °C, similaire à la température observée avec les radiofréquences [38,8 °C]). De plus, un contrôle positif MG132 (inhibiteur du protéasome, induisant un stress protéotoxique) a été inclus pour l’étude de l’expression de HSP70. Une approche originale a été l’utilisation du « cellomics array scan » qui permet de visualiser la fluorescence de cellules individuelles. Les résultats ne montrent aucun effet propre des radiofréquences sur l’expression des 3 protéines d’intérêt.

Les auteurs concluent que les effets hypoalgésiques des radiofréquences ne seraient pas liés à une modulation de l’expression de ces protéines, et que la mesure de l’activité de ces canaux ioniques mériterait d’être investiguée.

Les résultats de cette étude ne montrant pas d’implication de récepteurs spécifiques à la douleur comme TRPV1 diffèrent de ceux de Romanenko et al. 2019, qui proposent un rôle possible de ces même récepteurs TRPV1 dans les effets analgésiques des radiofréquences.

Cependant, les approches diffèrent, l’étude de Haas propose une mesure à un temps donné de l’expression de protéines dans une lignée cellulaire de type neuronal, alors que Romanenko et al. ont mesuré l’activité électrique de neurones spécifiques de la douleur, les nocicepteurs.

Les conditions d’exposition diffèrent également, à très court terme pour Romanenko et al. (3-5 min), à plus long-terme pour Haas et al. (24 h).

La 2^e étude de Haas et al. (2016b) avait pour objectif d'étudier les effets des radiofréquences sur la différentiation neuronale dans un modèle de cellules PC12 en culture traitées au NGF.

Les paramètres étudiés ont été les caractéristiques des neurites (longueur, angle, nombre/cellule) ainsi que l’expression de la β3-tubuline, une protéine du cytosquelette

spécifique des neurones. Trois groupes ont été inclus : radiofréquences (60,4 GHz, signal continu, 10 mW/cm²), sham et témoin de température (HC - heat control). Les résultats montrent qu’une exposition aux radiofréquences pendant 24 h n’a pas d’effet sur la croissance neuritique, ni sur la différentiation neuronale (expression de la protéine β3-tubuline et taux de présence de neurites sur les cellules). Les auteurs discutent ce résultat négatif au regard du type de signal (continu) et de la fréquence élevée du signal radiofréquence utilisé. Des données de la littérature semblent montrer notamment l’importance de la modulation du signal sur la croissance neuritique des cellules PC12 (Zhang Y et al., 2005, BEMS). Ces auteurs ont montré une inhibition de la formation des neurites de cellules PC12 (+NGF) après exposition à un signal RF intermittent (50 Hz, 10 % d’occupation du cycle), phénomène non observé lorsque le signal radiofréquences est continu (pas de différence avec la condition témoin sans exposition). En augmentant le temps de présence du signal (percentage pulse duty, 30 %, 50 %, 80 %...), le nombre de cellules formant des neurites augmente progressivement pour atteindre un maximum avec un signal continu. Par contre, si on mesure la longueur des neurites, l’effet inverse est observé, à savoir une diminution de leur longueur avec l’augmentation du pourcentage d’occupation du signal, pour atteindre un minimum lorsqu’il est continu. Ces données montrent la complexité des interactions des ondes radiofréquences avec les cellules en culture et le rôle de leurs caractéristiques (signaux continus vs intermittents).

La 3^e étude de Haas et al. (2017) a été réalisée également avec le modèle de cellules PC12 en culture traitées au NGF. L’objectif était l’étude de l’impact d’une exposition aux radiofréquences pendant 24 h (60,4 GHz, signal continu, densité de puissance 5 mW/cm²) sur le métabolisme de la dopamine. En effet, les cellules PC12 possèdent toute la machinerie métabolique (synthèse, libération, transport et catabolisme) de la dopamine, considérée comme un indicateur de l’activité neuronale globale et du métabolisme. Les paramètres étudiés ont été : i) le turnover de la dopamine (DA) et de son métabolite (DOPAC) intra- et extra-cellulaire, ainsi que la cinétique d’accumulation du DOPAC extracellulaire, mesurés par HPLC, et ii) l’expression de la protéine DAT (transporteur de la dopamine) et de la β-actine (protéine de contrôle) par immunohistochimie. Trois groupes ont été inclus : sham, exposé aux radiofréquences et contrôle température (HC - heat control). Les résultats montrent que l’exposition aux radiofréquences induit une augmentation modérée (non significative) du contenu en dopamine et DOPAC extracellulaire ; cette augmentation qui apparait aussi dans la condition témoin chaleur (HC), suggère un effet lié à l’augmentation de la température (1-2 °C) du milieu suite à l’exposition aux radiofréquences. Par contre, cette exposition n’a pas d’impact sur l’expression du transporteur de la dopamine (ni de la β-actine) en condition avec ou sans NGF (cellules différenciées ou non).

Il est à noter que le nombre de cultures ou expériences (n = 4 ou 5) pour certaines mesures (contenu en DA et DOPAC intracellulaire, expression de la protéine DAT) est faible et pourrait expliquer les écarts-types élevés et l’absence de conclusion ferme quant aux effets possibles des radiofréquences sur le métabolisme cellulaire de la dopamine. Enfin, l’approche en immunohistochimie de l’expression de protéines ne permet pas une véritable quantification, au contraire de la technique du western blot.

Samsonov et Popov (2013) ont étudié les effets thermiques et non thermiques des radiofréquences (94 GHz, densité de puissance 31 mW/cm²) sur des neurones en culture (modèle d’embryon de Xénopes) sur le taux d’assemblage des microtubules, composants du

cytosquelette assurant différentes formes de transports antérogrades et rétrogrades, essentiels à la fonction neuronale. Leur approche visait à comprendre les mécanismes de la nociception thermique impliquant plusieurs sous-types de canaux, comme les TRPV1, sachant que tout changement des microtubules affecte l’activité fonctionnelle de ces canaux. Ce modèle in vitro de culture d’embryons de Xénope a été au préalable validé par les auteurs. De même, la mise au point de la méthode de mesure et de contrôle des variations de la température des cultures (technique du microfilm) au niveau des neurones individuellement a été validée. Enfin, les méthodes de visualisation de la dynamique des microtubules par fluorescence (étude de la protéine associée aux microtubules, EB1 couplée à la GFP [green fluorescent protein]) ont, elles aussi, été mise au point au préalable. Des cultures témoin température ont été incluses (1. effet température [30 °C], 2. Exposition aux radiofréquences sans augmentation de la température [22 °C]). Les résultats montrent que : i) l’exposition aux

cytosquelette assurant différentes formes de transports antérogrades et rétrogrades, essentiels à la fonction neuronale. Leur approche visait à comprendre les mécanismes de la nociception thermique impliquant plusieurs sous-types de canaux, comme les TRPV1, sachant que tout changement des microtubules affecte l’activité fonctionnelle de ces canaux. Ce modèle in vitro de culture d’embryons de Xénope a été au préalable validé par les auteurs. De même, la mise au point de la méthode de mesure et de contrôle des variations de la température des cultures (technique du microfilm) au niveau des neurones individuellement a été validée. Enfin, les méthodes de visualisation de la dynamique des microtubules par fluorescence (étude de la protéine associée aux microtubules, EB1 couplée à la GFP [green fluorescent protein]) ont, elles aussi, été mise au point au préalable. Des cultures témoin température ont été incluses (1. effet température [30 °C], 2. Exposition aux radiofréquences sans augmentation de la température [22 °C]). Les résultats montrent que : i) l’exposition aux