O projeto do novo dispositivo é mostrado e explicado nas Figuras A4.1 e A4.2. Ele foi desenhado com base no gerador de gradientes de concentração em forma de árvore (“tree-shaped gradient generator”): seja o escoamento no interior dos microcanais laminar, e sejam C1 a concentração da solução a ser introduzida pelo canal superior esquerdo e C2 a concentração da solução a ser introduzida pelo canal superior direito. Se os canais de saída apresentam dimensões iguais, é possível garantir que a concentração de saída no canal inferior esquerdo será igual a C1, a concentração de saída no canal inferior direito será igual a C2, e a concentração de saída no canal inferior central será igual à média aritmética das duas concentrações, (C1 + C2)/2 (WANG et al., 2017).
Além disso, como na geometria de árvore os gradientes de concentração são formados pela divisão e pela recombinação de fluxos dos microcanais, as concentrações podem ser consideradas constantes dentro de um mesmo microcanal no qual a mistura tenha se completado. Deste modo, todas as microcâmaras em contato com um mesmo microcanal do projeto da Figura A4.1 são submetidas à mesma concentração de solução que escoa (WANG et al., 2017).
As estruturas em forma de “serpentina” próximas às porções centrais dos microcanais têm a função de garantir que ocorra a mistura e que exista homogeneidade das soluções antes que elas cheguem à região das microcâmaras (KARNIK, 2015). Isto garante a validade da consideração de que as concentrações são constantes para cada câmara.
Com base neste design, foram propostos 2 projetos de microfermentador a ser fabricados por meio de diferentes técnicas e com diferentes posições de inserção das fibras ópticas.
Problemas operacionais verificados para o Projeto II (inserção lateral)
Este sistema mostrou uma série de desvantagens operacionais em relação ao Projeto I, sendo a mais notável o fato de que pode monitorar apenas duas câmaras ao mesmo tempo. Além disso, existe dificuldade considerável não apenas para remover a fibra para limpeza e para o ajuste de referencial do sensor, mas, principalmente, para reinseri-la ao dispositivo. Não é possível realizar esta tarefa durante o experimento, pois isto resultaria em vazamentos pelos canais laterais.
Um problema grave que ocorreu ao fim do experimento de teste deste projeto foi justamente o fato de que uma das fibras ópticas se soltou do reator devido à presença de pequenas tensões mecânicas inerentes à própria montagem experimental. Como este microrreator exige que um comprimento longo de fibra (um material vítreo e frágil) esteja exposto para que o sensor alcance o interior das microcâmaras (ou seja, as proteções de PVC e kevlar devem ser removidas dos cabos de fibra óptica), este tipo de ocorrência passa a ser bastante delicada. De fato, ocorreu a fratura da fibra ao se tentar reposicioná-la. Apesar de isto ter impedido a obtenção dos últimos dados de uma das câmaras, o uso das mesmas concentrações de substrato nos dois canais possibilitou a obtenção das medidas correspondentes.
Figura A4.2. Visão geral do projeto do microdispositivo adaptado, com todas as cotas expressas em milímetros.
Problemas operacionais verificados para o Projeto I e adaptações realizadas
Para os testes com o dispositivo de PDMS laminado-vidro (Projeto I), utilizou-se primeiramente a abordagem mais direta para a integração do sensor de fibra óptica ao microfermentador: o posicionamento simples da fibra sobre a porta de acesso superior da camada de vidro.
Diversos problemas foram observados neste teste: assim como verificado para o dispositivo de inserção lateral, há dificuldade em realizar o correto posicionamento da fibra e, como ela é mantida sem fixação, tem certa liberdade de movimento e pode perder o contato efetivo com o meio líquido; o baixo volume das câmaras mais uma vez prejudicou a estatística das medidas; como não foi utilizada nenhuma barreira que impedisse ao menos parcialmente a exposição das microcâmaras ao ar atmosférico,
ocorreu evaporação do meio líquido; verificou-se, em algumas ocasiões, o choque mecânico entre a ponta das fibras com as paredes do microrreator durante o processo de realinhamento. Este último problema resultou na formação de imperfeições superficiais que prejudicam a correta transmissão de luz na extremidade da fibra e, portanto, impedem a obtenção de sinais interpretáveis em termos de concentração celular (SALEH e TEICH, 1991).
Para solucionar o problema de transmissão, as fibras foram reclivadas e os aspectos morfológicos de suas pontas foram visualizados no microscópio óptico. Este procedimento foi repetido até a obtenção de imagens de pontas planas e capazes de transmitir corretamente a luz com mínimas perdas de intensidade. Por fim, as fibras foram inseridas na tampa de vidro e seladas com resina epóxi. A resina não só forneceu proteção mecânica extra às fibras e à tampa de vidro, mas também garantiu que elas permanecessem fixas às posições corretas, evitando novas quebras e reduzindo as perdas ópticas por macrocurvaturas. A imagem das três fibras monomodo é mostrada na
Figura A4.3, na qual é possível observar os seus diâmetros reais: 127, 124 e 125 μm.
Figura A4.3. Imagens de microscopia óptica de cada uma das três fibras corretamente clivadas. “D” indica o diâmetro real (destacado como um traço preto ao centro das imagens) medido para cada fibra.
Para permitir a obtenção de um sinal mais nítido, também foi feita uma mudança de projeto, que consistiu na fusão das 3 microcâmaras da camada de PDMS. Ao se formar uma câmara com aproximadamente o triplo do volume inicial, aumentou-se o número de partículas detectadas pelo sensor e, consequentemente, o grau de confiança das estatísticas de autocorrelação da intensidade (HUNTER, 2004; SALEH e TEICH, 1991).
Esta fusão das câmaras não constituiu um problema: como só foi possível inserir uma fibra por canal e como foi feita a selagem da camada de vidro com resina, impedindo a visualização superior por microscopia, duas das câmaras abaixo de cada canal não poderiam ser analisadas, o que tornaria a sua presença redundante para o projeto. A imagem da região de junção entre as microcâmaras é mostrada na Figura
Figura A4.4. Região de junção entre as microcâmaras.
A terceira e última modificação necessária para obtenção de uma leitura confiável foi o retorno à ordem original de posicionamento das camadas de PDMS, de Vit et al. (2018): o canal de escoamento foi transferido ao nível superior, acima das microcâmaras, sendo as fibras ópticas inseridas abaixo das câmaras. Desta forma, ficou garantido que, devido à ação gravitacional, o fluido não perderia contato com as fibras.
ANEXO V - Lista de publicações