Effet des traitements de marinage, de séchage, de réfrigération

Les traitements mis en œuvre sur des tilapias sont le marinage, une méthode de conservation populaire des poissons, le séchage à température élevée destinés à la fabrication de la farine de poisson, la réfrigération à 4°C et le filetage. La majorité des auteurs qui ont étudié l’influence d’un traitement technologique sur la résistance

1, 2, 3, 4, 5 : 5 poissons différents 1, 1’, 1’’ : 3 échantillons du même poisson

d’un germe ou d’un groupe de germes particuliers, inoculent à fortes doses puis recherchent les germes ensuite en faisant varier les paramètres du traitement (Clavero et Beuchat, 1996 ; Ellajosyula et al., 1998 ; Nascumento et al., 1998).

Nous avons choisi de ne pas inoculer avec des souches microbiennes témoins nos poissons pour plusieurs raisons :

9 cela impliquerait des problèmes d’ordre sanitaire lors de transformation comme le séchage (production d’aérosols) ;

9 puisque nous souhaitons étudier l’influence de chaque traitement, il serait incohérent de faire subir en amont une stérilisation à nos poissons (comportement différents des tissus ensuite) ;

9 on ne sait pas encore quel germe ou quels groupes de germes sont susceptibles d’être des marqueurs donc le choix d’un microorganisme particulier serait aléatoire ;

9 Enfin, l’objectif du travail est de tracer un poisson quel qu’il soit avec sa charge microbienne naturelle. Une étude par inoculation par une bactérie d’intérêt pourra être envisagée lorsque les marqueurs auront été déterminés, ce qui donnera des renseignements sur leur possibilité de survie aux traitements technologiques.

Les résultats de DGGE d’ADN bactérien extrait de filets de Tilapias ayant subit le filetage, le marinage, le séchage et la réfrigération à 4°C sont représentés sur la figure III.22. Les profils de DDGE avant et après le filetage sont identiques, et on peut constater 9 bandes bien distinctes. Après le marinage et le séchage, une diminution du nombre de bandes est observée. A partir de 9 bandes au début, le nombre de bande diminue jusqu’à 5 pour les poissons ayant subis le marinage et jusqu’à 3 pour les poissons ayant subis le séchage. Par contre, il y a une augmentation du nombre de bandes jusqu’à 10 bandes pour les poissons réfrigérés à 4°C.

L’analyse de similarité confirme bien la différence observée pour les profils bactériens des poissons ayant subit les traitements technologiques (Figure III.23). Nous constatons que tous les filets non traités se retrouvent dans le même groupe avec 100% de similarité, et que les filets réfrigérés se regroupent dans le même cluster que les filets non traités avec 98% de similarité. De plus, avec 94% de similarité, on distingue 2 clusters : le premier cluster contient les filets non traités, les filets réfrigérés et les filets marinés ; le deuxième cluster contient les filets séchés.

E. coli L.pla n tar u m F-b

F-b F-a M-b M-a S-b S-a R-b R-a E. coli L. pla

n

taru

m

Figure III.22. : Photo de gel DGGE d’ADN bactériens extraits de filets de tilapias ayant subit des traitements.

F: le filetage ; M : le marinage ; S : le séchage ; R : la

réfrigération à 4°C b : avant le traitement a : après le traitement

Après le filetage, nous avons constaté qu’il n’y a pas d’évolution des flores microbiennes. Ceci peut être du aux bonnes conditions sanitaires du filetage qui limite les contaminations qui se trouvent dés lors au-dessous du seuil de détection de la PCR-DGGE.

Le marinage a été réalisé selon la méthode de marinage rapide de Poligné et Collignan (2000). Ce procédé d’immersion rapide offre une bonne alternative aux techniques de marinage conventionnelles. Les poissons sont ainsi marinés rapidement pendant 60 min, au lieu de quelques jours selon le processus traditionnel. La solution contient une haute concentration en acide et en sel et elle est agitée, ce qui permet des transferts de masse optimaux en empêchant la formation d’une couche extérieure diluée sur les filets de poissons (Bohuon et al., 1998). Après le traitement, le pH des filets atteint 3,85 ± 0,1. Avec cette méthode, Poligné et Collignan (2000) ont montré que les anchois marinés peuvent être conservés pendant 2 mois à 4°C sans développer de contamination. Après le marinage, il y a une diminution des bandes des profils DGGE (Figure III.22). Ce qui peut indiquer un effet destructif sur les flores bactériennes présentes sur les filets de poissons ou un effet sur l’ADN bactérien présent sur les filets qui est dénaturé donc difficilement extractible et amplifiable par PCR. Il a été montré que le traitement par un acide

S-a M-a R-a M-b S-b R-b F-b F-a 85 90 95 100 Similarité Filets témoins Filets réfrigérés Filets marinés Filets séchés b : avant le traitement a : après le traitement

Figure III.23. : Dendrogramme des profils DGGE d’ADN bactériens extraits de filets de tilapias ayant subit des traitements

cause la dépurination de l’ADN (Lindahl, 1993) et empêche l’amplification par PCR (Master et al., 1994 ; Ma et al., 1994). Cependant, un temps de traitement court peut être insuffisant pour détruire l’ADN (Prince et Andrus, 1992). Herman (1997) a montré qu’après un traitement avec 6,7% d’HCl pendant 5 min, l’ADN de

L. monocytogenes peut encore être amplifié par PCR. Dans une autre expérience,

E. coli et L. monocytogenes ont subit un traitement par HCl à pH 2 et sont encore

détectés par PCR après 24h et 16h, respectivement (Master et al., 1994).

Pour le séchage, nous avons choisi un séchage mettant en jeu une température élevée, soit 3 heures de séchage à 120°C. Après ce traitement, la teneur en eau des filets est de 16,5% ± 1,5. Cette faible teneur permet une bonne conservation des filets (Oksuz et al., 2008) mais est encore élevée pour la farine dont la teneur en eau varie de 7,2% à 15,5% (Kume et al., 1983 ; Opstvedt et al., 2003 ; Wang et al., 2006). Après le séchage, un appauvrissement du profil DGGE est observé (Figure III.22). Cette diminution du nombre de bandes sur le gel témoigne de la destruction thermique des souches bactériennes initialement présentes sur les filets.

La résistance thermique dépend de la composition de la flore microbienne endogène des aliments. Les bactéries à Gram positif sont souvent plus sensibles à la chaleur que les bactéries à Gram négatif (Mossel et al., 1995. La chaleur peut endommager l’ADN par des réaction de dépurination ou de désamination et, à température élevée, peut causer la scission de double brins et la perte irréversible de la structure secondaire de l’ADN (Pellon et Sinskey, 1984 ; Miles et al., 1986). Cependant, lors de la PCR-DGGE, on peut encore observer quelques bandes preuve que tout l’ADN n’est pas dénaturé. Ce résultat est en accord avec l’étude de Master et al. (1994) qui ont montré qu’à 121°C, l’ADN est partiellement endommagé mais reste amplifiable par PCR. McKillip et al. (1999) ont également prouvé la stabilité de l’ADN d’E. coli après un traitement thermique à 60°C pendant 48h dans le lait. Nogva et al. (2000) ont montré qu’à 72°C, après 24h, l’ADN de Campylobacter

jejuni peut encore être amplifié par PCR et qu’après un traitement à 100°C pendant

6h, on peut encore amplifier l’ADN, alors qu’après 24h, cette limite de détection est atteinte.

Concernant la réfrigération, les profils bactériens ont été réalisés après 2 semaines de conservation des filets à 4°C. L’observation du profil DGGE montre l’apparition d’une nouvelle bande et on peut également constater que l’intensité de

certaines bandes est plus élevée. On peut émettre l’hypothèse que certaines bactéries psychrophiles ou psychrotrophes peuvent se sont développées pendant la réfrigération. Fagan et al. (2003) ont signalé une augmentation de 1 log10UFC/g de la population bactérienne de filets de maquereaux et de 2 log10UFC/g de filets de saumons réfrigérés à 4°C après 3 jours. Patsias et al. (2008) ont également montré une augmentation de 4 log10UFC/g de la population bactérienne totale des filets de poulets après 9 jours de conservation à 4°C. Des Listeria et des Pseudomonas peuvent se développer durant la réfrigération (Farber et Peterkin, 1991 ; Coates et

al., 1995 ; Widders et al., 1995).