ANALYSE DE BARS ÉLEVÉS DANS TROIS RÉGIONS DIFFÉRENTES

Les échantillons analysés sont des poissons de la même espèce mais élevés dans le même pays, soit dans des régions différentes, soit dans des aquariums différents.

Les échantillons de poissons utilisés lors de cette étude sont des bars qui viennent de fermes aquacoles de différentes régions et de milieux aquatiques différents :

• Établissement de l’Ifremer Palavas (Montpellier), aquarium K : Mer méditerranée.

• Société « Les bars du soleil » (Sète) : Mer méditerranée. • Société Aquanord (Gravelines) : Mer du Nord.

Pour chaque poisson, une extraction des ADN totaux a été réalisée suivie d’une amplification par PCR.

Sur le gel de vérification de l’extraction des ADN (Figure III.2), des bandes intenses et nettes sont observées dans les zones de hauts poids moléculaires, avec des bandes moins intenses dans les zones de faibles poids moléculaires. La position des bandes de hauts poids moléculaires correspond à celles de fragments de plus de 10 kb qui sont sans doute de l’ADN génomique microbien combiné à de l’ADN génomique de poisson. L’aspect des bandes obtenues rend compte d’une quantité suffisante d’ADN extrait qui permet de réaliser une amplification par PCR. Ceci démontre l’efficacité de la méthode optimisée au laboratoire pour l’extraction directe des ADN bactériens à partir du poisson.

Le témoin négatif a été réalisé par extraction d’ADN par du tampon TE. L’absence d’ADN sur le témoin négatif montre bien qu’il n’y a pas de contamination de tous les réactifs utilisés pour l’extraction.

La purification est une étape importante et rendue difficile parce que les matrices (poisson) contiennent des lipides, des protéines, des polysaccharides et des sels qui diminuent les rendements d’extraction et peuvent être retrouvés mélangés aux extraits d’ADN (Wilson, 1997). Ces résidus pourraient également agir comme inhibiteurs lors de l’amplification par PCR.

Figure III.2. : Photo de gel d’agarose à 0,8% de vérification de l’efficacité de l’extraction d’ADN bactériens extraits de bars de différentes origines géographiques.

Bandes d’ADN génomiques

1 kb M1 M2 M3 S1 S2 S3 G1 G2 G3 BM1 BM2 BM3 T

1 kb : marqueur de taille 1 kb

M1, M2 ; M3 : bars de l’Ifremer Palavas (Montpellier)

S1, S2, S3 : bars de la société « Les bars du soleil (Sète)

G1, G2, G3 : bars de la société Aquanord (Gravelines)

BM1, BM2, BM3 : bars de la société du Viviers du Gois (Beauvoir sur Mer)

100 pb M1 M2 M3 S1 S2 S3 G1 G2 G3 BM1 BM2 BM3 T

Le résultat de l’amplification par PCR par les amorces GC 338f et 518r de l’ADN microbien extrait des poissons est visible sur la figure III.3. Sur le gel d’agarose, les produits de PCR donnent des bandes uniques, nettes et intenses situées entre 298 pb et 220 pb, ce qui correspond à la taille attendue qui est de 236 pb. Le témoin négatif a été réalisé avec le mélange réactionnel sans ajout d’ADN extrait. L’absence de bande pour le témoin négatif montre qu’il n’y a pas de contamination du mélange réactionnel de PCR.

Figure III.3. : Photo de gel d’agarose à 2% de vérification de l’amplification d’ADN bactériens extraits de bars de différentes origines géographiques.

Les résultats obtenus montrent que la qualité et la quantité des ADN totaux extraits des bactéries des poissons sont bonnes et qu’aucun inhibiteur ne semble avoir une influence sur la réaction d’amplification. Les produits de PCR réalisés avec les ADN bactériens extraits des poissons sont analysés par DGGE. Les résultats de cette électrophorèse sont montrés dans la figure III.4.

Sur le gel, on peut observer que les ADN extraits des deux souches témoins ont donné des bandes intenses et uniques situées aux positions attendues, ce qui montrent le bon déroulement de la DGGE.

Sur le gel, on peut observer de 4 à 6 bandes intenses et distinctes pour chaque dépôt. Le profil DGGE des poissons d’un même aquarium est identique et se différencient des profils obtenus avec les poissons d’origine différente par le nombre et la position des bandes. Malgré le nombre restreint de bandes observées, l’analyse statistique (Figure III.5) des profils DGGE montre que les profils obtenus avec les poissons de la même origine se regroupent dans un cluster unique avec

100 pb : marqueur de taille 100 pb M1, M2 ; M3 : bars de l’Ifremer Palavas (Montpellier)

S1, S2, S3 : bars de la société « Les bars du soleil » (Sète) G1, G2, G3 : bars de la société Aquanord (Gravelines)

BM1, BM2, BM3 : bars de la

société du Viviers du Gois (Beauvoir sur Mer)

100% de similarité. Les profils de bars élevés en mer Méditerranée (Montpellier et Palavas) se regroupent dans un grand cluster avec 88% de similarité. Les profils de bars élevés dans la Mer du Nord (Gravelines) et l’océan Atlantique (Beauvoir sur Mer) se regroupent aussi dans un grand cluster avec 82% de similarité. A l’intérieur de ces deux groupes, les profils des poissons d’origines différentes sont bien différenciés. Enfin, les profils des bars de Méditerranée et ceux des autres origines se distinguent clairement avec seulement 70% de similarité.

Les poissons analysés sont issus d’élevages aquacoles, à l’exception de ceux de Palavas qui sont élevés en aquarium, qui sont en relation directe avec le milieu sauvage avec 3 environnements vraiment différents comme la salinité, la température, la qualité des eaux mais aussi par les pratiques d’élevage en particulier l’alimentation qui peut varier d’une entreprise à l’autre. Il n’est donc pas surprenant de trouver cette différenciation des profils, à savoir une certaine similarité entre les profils méditerranéens d’une part et ceux de l’océan et de la mer du nord d’autre part car des études sur les flores microbiennes aquatiques sur des poissons capturés dans divers endroits géographiques ont montré qu’elles étaient étroitement associées au statut physiologique des poissons, à leur qualité hygiénique et aux conditions d’élevage (Okpokwasili et Alpapiki, 1990 ; Grisez et al., 1997 ; Spanggaard et al., 2000; Leesing, 2005). Les microflores bactériennes aquatiques sont à la surface des poissons et dans leurs intestins (Sugita et al, 1985). Des études ont montré que les flores intestinales reflètent les flores de l’environnement aquatique, et en particulier de celle de l’alimentation (Campbell et Buswell, 1983 ; Nieto et al. 1984).

Les profils des poissons capturés dans le même enclos sont rigoureusement identiques. Cela rejoint les observations de Al-Harbi et Uddin (2005) qui ont caractérisé la flore bactérienne intestinale des Tilapias élevés dans 3 étangs différents. Dans chacun des étangs, la population bactérienne des poissons était étroitement similaire.

A la vue de ces résultats, on peut aussi s’interroger du faible nombre de bandes observées dans chacun des profils car l’obtention de profils avec un petit nombre de bandes témoigne soit de la faible diversité microbienne dans le milieu, soit de l’incapacité de la méthode à mettre en évidence l’essentiel des souches bactériennes présentes dans les échantillons. Nous pensons qu’il s’agit plutôt ici de l’expression de l’appauvrissement de la diversité liée aux conditions d’élevage car le

E. coli L. plantarum M-1 M-2 M-3 S-1 S-2 S-3 G-1 G-2 G-3 BM-1 BM-2 BM-3 E. coli L. plantaru

m

protocole utilisé pour nos analyses en PCR DGGE est celui optimisé par Leesing en 2005 qui permet d’explorer au mieux la diversité bactérienne.

Figure III.4. : Photo du gel de DGGE d’ADN bactériens extraits de bars de différentes origines géographiques.

M : Bars de l’Ifremer Palavas (Montpellier) S : Bars de la société « Les bars du soleil » (Sète)

G : Bars de la société Aquanord (Gravelines)

BM : Bars de la société du Viviers du Gois (Beauvoir sur Mer)

Figure III.5. : Dendrogramme des profils DGGE d’ADN bactériens extraits de bars de différentes origines géographiques.