Effet des CA-MSC sur la polarisation des macrophages

Les CA-MSC isolées de tumeurs ovariennes et les CA-MSC « induites » par notre modèle sécrètent plus de chimiokines que les MSC physiologiques. Ainsi, cette production accrue de chimiokines pourrait entrainer un recrutement plus important de cellules immunitaires au niveau tumoral qui pourraient à leur tour influencer le développement de ces carcinomes. En effet, les cellules du système immunitaire peuvent agir fortement sur le développement tumoral en ayant un rôle soit anti-tumoral (lymphocytes T cytotoxiques, macrophages M1, etc.), soit pro-tumoral (lymphocytes T régulateurs, macrophages M2, etc.).

a) Identification de facteurs surexprimés par les CA-MSC « induites » pouvant interagir avec les macrophages

Du fait que les CA-MSC sécrétaient, entre autres, plus de chimiokines que les MSC physiologiques, une interaction entre les CA-MSC et des cellules immunitaire a été étudiée. Une attention particulière a été portée sur leur éventuelle interaction avec les macrophages car des travaux antérieurs de mon laboratoire de thèse avaient montré le rôle des Hospicells (cellules apparentées à des CA-MSC) dans le recrutement et la polarisation des macrophages66_. Une analyse des résultats de transcriptomique présentée précédemment (Figure 24A) a montré que les CA-MSC « induites » (par des CTO IGROV-1) avaient une augmentation de la transcription de l’IL-6 et de LIF (leukemia inhibitory factor). Ces deux facteurs ont été décrits comme étant capables de polariser les macrophages vers un phénotype M2d72_{. Ce phénotype} M2d est le phénotype des macrophages associés aux tumeurs (TAM) qui sont retrouvés dans le cancer ovarien et qui sont de mauvais pronostic.

Nous avons donc voulu valider si les CA-MSC « induites » par notre modèle sécrétaient plus d’IL-6 et de LIF. Une analyse par RT-qPCR a montré que la transcription en ARNm de ces deux gènes était plus élevée dans les CA-MSC « induites » par les CTO (IGROV-1 et SKOV- 3) mais pas par celles induites par l’ascite (Figure 35).

145 Figure 35 : analyse de la transcription de l'IL-6 et de LIF dans les CA-MSC "induites"

Après 21 jours de culture des BM-MSC dans du milieu contrôle (MSC/physio) ou en présence de MC de cellules IGROV-1 (MSC/igrov-1), de MC de cellules SKOV-3 (MSC/skov-3) ou d’ascites (MSC/ascite), les ARN totaux de ces cellules sont extraits puis leur ADNc est synthétisé par reverse transcription. La quantité relative d’ADNc, issus des ARN totaux des BM- MSC et CA-MSC « induites » est évaluée en réalisant une PCR quantitative (qPCR). La transcription relative de chacun des gènes évalués est calculée par rapport à la transcription de la GAPDH. Les gènes codant pour LIF (A) et IL-6 (B) sont analysés.

Ainsi, le modèle de CA-MSC « induites » par les CTO entraine la transcription de facteurs, l’IL-6 et LIF, impliqués entre autres dans la polarisation M2d, correspondant au phénotype des macrophages retrouvés dans le cancer ovarien et associée à une activité pro-tumorale.

b) Effet des sécrétions des CA-MSC sur le phénotype des macrophages

Nous avons donc identifié des facteurs sécrétés par les CA-MSC « induites » par les CTO qui pourraient potentiellement moduler le phénotype des macrophages. Afin de montrer que ces facteurs secrétés modifient effectivement le phénotype des monocytes/macrophages, nous avons cultivé des monocytes humains primaires en présence de MC de BM-MSC ou de CA- MSC « induites ». Un des marqueurs principaux des macrophages de type M2 est le fait qu’ils produisent de l’IL-10. Nous avons observé qu’en présence de MC de CA-MSC « induites » (par les cellules IGROV-1 ou SKOV-3), la transcription de l’IL-10 par les monocytes est fortement augmentée (Figure 36A) comparée à des monocytes non stimulés (contrôle) et contrairement au MC de BM-MSC. Nous avons montré que de nombreux autres gènes codants pour des marqueurs de macrophages de type M2 (Tableau 5) étaient également plus transcrits dans les monocytes qui avaient été cultivés dans du MC de CA-MSC « induites » comparés à ceux cultivés avec du MC de BM-MSC (Figure 36B).

146 Figure 36 : Effet des sécrétions des CA-MSC "induites" sur la transcription des gènes marqueurs d'une polarisation M2 dans des monocytes humains primaires

1.105 _{PBMC sont ensemencés dans des puits de plaque 48 puits. Les monocytes sont sélectionnés par adhésion (2h) puis ils}

sont mis en présence de MC de BM-MSC ou de CA-MSC « induites ». 24 heures après, les monocytes sont placés dans du tampon de lyse. Les ARN totaux de ces monocytes sont extraits puis leur ADNc est synthétisé par reverse transcription. La quantité relative d’ADNc, issus des ARN totaux des BM-MSC et CA-MSC « induites » est évaluée en réalisant une PCR quantitative (qPCR). La transcription relative de chacun des gènes évalués est calculée par rapport à la transcription de la GAPDH. Les gènes codant pour l’IL-10 (A), le CD36, CD163, CCL17, IDO2, IL-1ra, PGES, TGF-β et VEGF (B) sont analysés. Les signes +, ++ et +++ correspondent respectivement à une augmentation de la transcription, par rapport à celle des monocytes non stimulés, d’un facteur supérieur à 2, 5 et 10.

Ainsi, les facteurs sécrétés par les CA-MSC « induites » sont capables de modifier le phénotype de monocytes humains primaires vers un phénotype de TAM de type M2.

c) Effet des sécrétions des CA-MSC sur l’activité cytotoxique des macrophages vis-à-vis des cellules tumorales ovariennes

Après avoir étudié le rôle des facteurs sécrétés par les CA-MSC sur le phénotype des macrophages, nous avons étudié si ces facteurs pouvaient modifier les caractéristiques fonctionnelles des monocytes/macrophages. Pour cela, nous avons réalisé une expérience de co-culture entre des CTO et des monocytes ayant été préalablement activés par du MC de CA- MSC, de CA-MSC « induites » ou de liquide d’ascite (contrôle positif de polarisation car Duluc et al. ont montré que l’ascite modifiait le phénotype des macrophages vers un phénotype M2d72_, correspondant aux TAM ovariens). Les CTO utilisées sont des cellules IGROV-1 transduites pour exprimer la luciférase permettant d’évaluer à la fin de l’expérience uniquement la viabilité des CTO par luminescence.

Nous avons observé que la co-culture de CTO avec des monocytes induit une mort importante des CTO (Figure 37 A et B) mettant en évidence le rôle tumoricide des macrophages. Le MC de BM-MSC ne modifie pas les l’activité tumoricide des monocytes. En effet, nous constatons une mort des cellules IGROV-1luc induite par ces monocytes, de façon comparable au milieu

147 contrôle. En revanche, la polarisation des monocytes par l’ajout de MC de CA-MSC « induites » ou de CA MSC isolées de tumeurs ovariennes entraine une réduction de l’activité cytotoxique des monocytes vis-à-vis des CTO, de manière comparable à l’ajout de l’ascite (contrôle positif) (Figure 37A et B).

Figure 37 : Effets des monocytes sur la viabilité des cellules tumorales ovariennes

5.105 _{PBMC (correspondant à environ 5.10}4 _{monocytes) sont ensemencées dans des plaques 96 puits blanches. Après 2h}

d’adhésion, le milieu est remplacé par le MC (dilué au demi dans du milieu Macrophage-SFM) de MSC, CA-MSC, CA-MSC « induites » ou d’ascites. Le lendemain, 2,5.104 _{CTO IGROV-1luc sont ajoutées dans les puits. Après 3 jours de co-culture, la}

viabilité cellulaire des CTO IGROV-1luc est évaluée par la bioluminescence émise après ajout de luciférine.

Ainsi, les facteurs sécrétés par les CA-MSC et CA-MSC « induites » semblent entrainer un phénotype permissif chez les monocytes/macrophages en diminuant leur activité cytotoxique vis-à-vis des CTO. Cette modification fonctionnelle semble équivalente à celle observée avec de l’ascite de patientes atteintes de tumeurs ovariennes qui ont été décrites comme inductrices de phénotype M2d pour les macrophages.

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2) Etude du rôle des MSC sur la polarisation des macrophages dans des