Très peu d’études ont été réalisées sur la cristallisation et la dissolution des pyrophosphates de calcium que ce soit en présence ou non d’additifs. Les quelques études menées entre les années 1995 et 2003 sont abordées dans cette partie.
- Le cation Mg2+
Cheng et Pritzker (Cheng and Pritzker, 1983) ont montré que l’ion magnésium favorise l’obtention de cristaux de la phase m-CPPD plutôt que t-CPPD lors d’une étude faisant varier simultanément les concentrations en ions Ca2+ et Mg2+ lors de la synthèse de CPP. Il semblerait que la formation de cristaux de CPPD pourrait être initiée dans le cartilage avec une concentration « normale » en ions calcium dans le liquide synovial ([Ca2+] = 0,5 à 2,4
83 concentration en ions Mg2+. Ce résultat a été obtenu lors d’une étude au cours de laquelle les
auteurs ont étudié en solution aqueuse à 37°C, pH 7,4 et [Na+] = 140 mM, l’influence de la
concentration en ions calcium, magnésium et pyrophosphate sur la formation de cristaux de CPP en solution aqueuse dont quelques résultats remarquables sont présentés sur la Figure I- 28. Cette figure illustre les conditions d’obtention des phases de cristaux à partir d’une solution aqueuse de CaCl2/MgCl2 et 0,05 mM Na4P2O7 (a) ou 0,50 mM Na4P2O7 (b) à pH 7.4,
37°C et [Na+] = 140 mM. On note que les zones d’obtention de CPP correspondent à un très grand nombre de couples [Ca2+]/[Mg2+] lorsque la concentration en pyrophosphate augmente
(Figure I-28 ; a et b). A faible concentration en pyrophosphate, la diminution de la concentration en ions Mg2+ promeut la formation de CPP (Figure I-28 ; a). Et enfin quelle
que soit la concentration en pyrophosphate l’augmentation de la concentration en ions Ca2+
favorise l’obtention de CPP.
Les auteurs ont réalisé leurs essais avec trois concentrations différentes de pyrophosphate de sodium afin d’obtenir un précipité de pyrophosphate de calcium en quantité suffisante pour être analysé. Pour cette étude, les conditions de synthèse n’ont donc pas été spécifiquement contrôlées pour la précipitation d’une phase de CPP en particulier. De ce fait, à partir de ces travaux, nous ne sommes pas en mesure de déterminer sur quelle(s) phase(s) l’ion Mg2+ a agi. Le mécanisme d’action avec lequel l’ion Mg2+ a influencé la cristallisation
des CPPD n’a pas été déterminé. Il s’agit donc d’un point qui sera repris et approfondi lors de cette thèse.
Figure I-28- Résumé graphique des phases de cristaux obtenus dans une solution aqueuse de CaCl2/MgCl2 et 0,05 mM Na4P2O7 (a) ou 0,50 mM Na4P2O7 (b) à pH 7.4, 37°C et [Na+] = 140 mM.
Les flèches indiquent l’augmentation de la quantité d’un cristal en particulier. (Cheng and Pritzker, 1981) ; NIL signifie nothing (pas de formation de CPP) ; CMPP2 signifie pyrophosphate mixte de
84 - Polyamine, cations Mg2+ et Ca2+
La phosphatase alcaline (ALP) est une enzyme avec une activité pyrophosphatase capable de dissoudre des cristaux de pyrophosphates de calcium dihydratés (CPPD) via leur activité d’hydrolyse des liaisons P-O-P (groupements pyrophosphate) en orthophosphate (Figure I-29). Shinozaki et al. (Shinozaki and Pritzker, 1995), (Shinozaki et al., 1995), (Shinozaki and Pritzker, 1996) ont étudié l’activité de dissolution des CPPD en présence de polyamine, substrat connu pour améliorer l’activité de l’ALP.
Figure I-29-Réaction d’hydrolyse des groupements pyrophosphate notamment de l’adénosine triphosphate en groupements orthophosphate (adénosine monophosphate) montrant l’action de
l’enzyme pyrophosphatase
Ils ont utilisé un modèle in vitro pour des interactions cristaux-enzymes qui a été utilisé pour évaluer la dissolution de CPPD d’un point de vue aussi bien biologique, chimique que morphologique.
Au terme de cette étude, il a été démontré biochimiquement et morphologiquement que des polyamines telles que la spermidine peuvent améliorer l’activité de l’ALP pour dissoudre des cristaux de CPPD. Cette activité de dissolution est exacerbée en présence d’ion Mg2+ et inhibée en présence d’ion Ca2+ (Figure I-30). Il a été aussi démontré que la polyamine
améliore la dissolution des CPPD de manière stéréosélective sur les petites faces du cristal (plans 010) (Figure I-31), indiquées par la présence de petits « puits gravés » dans le cristal (Shinozaki and Pritzker, 1995)(Shinozaki et al., 1995). Ceci suggère que le taux de dissolution des cristaux de CPPD est limité par la disponibilité des faces susceptibles de se lier à l’ALP.
85 Cette étude suggère aussi que la polyamine et l’ALP ont un effet synergique sur l’activité de l’ALP lorsqu’elle est requise pour le métabolisme énergétique intracellulaire.
Figure I-30-Effet combiné de deux types de polyamine et d'ions sur la dissolution de cristaux de CPPD ; 2,5 g de cristaux de t-CPPD ont été incubés avec 10 U d’ALP dans une solution tampon à pH
7,4 contenant 0,1 M de Tris-HCl et 1 mM de spermine ou la combinaison de polyamine et 1 mM de [Mg2+] ou polyamine et 1 mM de [Ca2+], à 37°C pendant 72 heures (Shinozaki and Pritzker, 1995).
Figure I-31-Image MEB de cristaux de CPPD incubés avec de l'ALP et de la polyamine. Cristaux de CPPD incubés dans une solution tampon de 0,1 M de Tris à 37°C pendant 72 h. (A) cristaux de CPPD
seuls ; (B) cristaux de CPPD incubés avec 10 U d’ALP ; des puits rectangulaires indiquant de la dissolution sont observés sur la face en bout du cristal ; (C) cristaux de CPPD incubés avec 10 U d’ALP et 1 mM de spermine ; des puits rectangulaires plus petits mais plus nombreux qu’en (B) sont
86 - bisphosphonates ou diphosphonates
Les bisphosphonates, ou diphosphonates, sont des molécules indiquées dans le traitement de l’ostéoporose et dans certains cas de métastases osseuses (Verron et al., 2010). A noter que ces composés qui semblent avoir des effets sur la formation de phosphate de calcium et la calcification in vitro et in vivo possèdent des liaisons P-C-P pour lesquelles une analogie peut être faite avec les liaisons P-O-P présentent au sein des pyrophosphates inorganiques et autres phases condensées de phosphates. Cependant, à la différence des phosphates présents dans l’os, les bisphosphonates ne sont que très difficilement résorbés par les ostéoclastes car ils inhibent l’activité de ces cellules qui habituellement résorbent l'os « vieux » pendant que les ostéoblastes en fabriquent du « neuf » et rendent donc les phosphates de calcium auxquels ils sont associés peu résorbables. Shinozaki et al. (Shinozaki and Pritzker, 1996) ont montré que les bisphosphonates, l’orthovanadate, le cadmium et les ions Ca2+ inhibent l’activité de l’ALP. Le taux d’inhibition pour des concentrations identiques
intervient dans l’ordre suivant : orthovanadate > cadmium > calcium. Cette étude suggère qu’à forte concentration les bisphosphonates inhibent la dissolution des cristaux de CPPD via l’inhibition de l’activité de l’ALP en raison de leur affinité avec la surface des cristaux de CPPD.
En 2002, Christoffersen et Christoffersen (Christoffersen and Christoffersen, 2003) ont montré que les bisphosphonates (acide 1-hydroxyéthane 1,1-diphosphonique (HEDP)) retardent la formation ou inhibent la croissance des phases t-CPPD et m-CPPT β pour une concentration supérieure à 10 µM. Ceci serait dû à une supposée adsorption de ce composé EHDP à la surface du cristal due à la ressemblance chimique avec les CPP. Cependant ils n’ont pas observé d’effet provoqué par les bisphosphonates sur la dissolution des phases t- CPPD, m-CPPD et m-CPPT β. Il est difficile de comprendre pourquoi l’EHDP n’a apparemment pas d'effet significatif sur les taux de dissolution des CPP, alors qu’il a un effet fortement inhibiteur sur les taux de dissolution de l'hydroxyapatite (HAP) (Christoffersen et al., 1983). Une explication possible pourrait être que la distance entre les ions Ca2+ à la surface de l’HAP est plus courte que celle à la surface des CPP.
87 - Interactions ions pyrophosphate - orthophosphate
Cheng et al. (Cheng and Pritzker, 1983) ont montré que le ratio orthophosphate/pyrophosphate est déterminant pour la forme de CPPD obtenue à l’issue de la cristallisation. Il paraîtrait qu’à de faibles concentrations en orthophosphate la formation de cristaux de CPPD est partiellement inhibée par les phosphates. Alors qu’à de fortes concentrations en orthophosphate, des CPP, des orthophosphates de calcium et des composés amorphes mixtes pyrophosphate-orthophosphate sont formés.
Les différents travaux effectués jusqu’ici sur la cristallisation et la dissolution des CPPD ont montré que quelques additifs ont une influence sur la cristallisation et la dissolution des pyrophosphates de calcium. Parmi les additifs étudiés on note la présence de l’ion Mg2+. Cet
ion fait partie avec le Cu2+, Zn2+ et Fe3+ des ions naturellement présents dans le corps humain. Les ions Cu2+, Zn2+ et Fe3+ tout comme l’ion thiosulfate (S
2O32-) ont déjà fait l’objet d’études
sur l’influence d’additifs en précipitation en qualité d’additif mais leur action sur la formation des CPP n’a jamais été étudiée. Nous avons choisi d’étudier par la suite l’influence des ions Mg2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+ et S
2O32- sur la formation des CPP. Cela permettra non seulement
d’étudier l’influence de simples additifs sur la formation mais aussi d’étudier l'interaction entre les cristaux de CPPD et des ions présents fluides corporels. Comme le suggère Christoffersen et al. (Christoffersen et al., 2001) une telle étude pourra éventuellement permettre de comprendre les processus impliqués in vivo et donc faire émerger des méthodes possibles de prévention et de traitement de la maladie à cristaux de CPPD.