6.2.1 – Sucres.
Les seuls sucres considérés dans notre étude et dosés au cours du suivi sont le glucose et le fructose.
6.2.1.1 – Sucres réducteurs totaux : DNS
Les sucres réducteurs (en raison de leurs groupements carbonyl libres C=O) réagissent avec le DNS (acide di-nitrosalycilique) en le réduisant en acide 3-amino-5-nitrosalicylique selon la réaction décrite sur la Figure 03-5.
Figure 03-5. Réaction du DNS avec un sucre réducteur.
Le DNS ou réactif dinitrosalicylique est préparé de la façon suivante : § 2,5 g d’acide 3,5-dinitrosalicylique
§ 75 g de sodium potassium tartrate § 4 g d’hydroxyde de sodium
Ces différents constituants sont dissous suivant l’ordre indiqué dans 250 mL d’eau distillée. Le réactif est conservé à l’obscurité à 4 °C et a une durée de vie de 15 jours.
Une solution mère de sucre de 2 g/L à 50% glucose et 50% fructose est utilisée pour la préparation de la gamme étalon (dilution au ¾, ½, et ¼ pour obtenir respectivement des concentrations de 1,5 ; 1 et 0,5 g/L).
Après avoir dilué l’échantillon pour être dans un intervalle de mesure cohérent avec la gamme étalon, on mélange dans des tubes à essai 1 mL de chaque échantillon et 1 mL de DNS. On homogénéise avant d’incuber les tubes surmontés d’une bille de verre pour éviter l’évaporation au bain-marie 5 minutes à 100°C. Les tubes sont par la suite refroidis dans un bain de glace et additionnés de 10 mL d’eau distillée.
Sucre réducteur
Sucre oxidé
La Densité Optique des mélanges réactionnels trempés est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre à 540 nm (cuve de 10 mm de trajet optique). Les différentes concentrations des échantillons sont déterminées à partir de la gamme étalon.
L’erreur maximale obtenue sur le dosage des sucres est de l’ordre de 6 %.
6.2.1.2 – Glucose : analyseur biochimique.
L’utilisation de l’analyseur biochimique à enzymes fixées YSI 2700 Select permet de déterminer la concentration en glucose d’un mélange. Le principe de l’appareil est l’oxydation par voie enzymatique (glucose-oxydase) du glucose. Il se forme alors du glucono-lactone et du peroxyde d’hydrogène (H2O2). Ce dernier est ensuite dosé par ampérométrie, le courant électrique généré étant
proportionnel à la quantité de glucose oxydé.
Il convient de diluer les échantillons afin de se trouver dans la gamme de mesure de l’appareil située entre 0 et 25 g.L-1.
Par ailleurs, le mélange à doser devant être totalement dépourvu de particules solides, on réalise au préalable une centrifugation de l’échantillon.
La présence de tanins interfère lors du dosage. Dans le cas d’échantillon type vin ou milieu tanisé, il convient alors d’éliminer ces composés avant d’effectuer la mesure avec le YSI. Pour ce faire, on additionne l’échantillon avec une solution de PVP à 40 g/L dans un rapport de 9 pour 1 (soit une concentration finale en PVP de 4 g/L). Après agitation de quelques minutes, on centrifuge à 5 °C à 12 000 tpm. Le surnageant est alors dosé. On tient compte de la dilution engendrée par le traitement.
6.2.2 – Azote assimilable.
6.2.2.1 – Titrage au formol.
Les cations (NH4 +
), et les groupes azotés des acides alpha-aminés (NH3 +
) présents dans l'échantillon constituent la principale source d'azote utilisée par les levures. Ils vont se combiner après neutralisation à pH 8,0 (formation de groupes carboxyliques libres) avec le formaldéhyde. Les protons libres ainsi formés vont être neutralisés par le NaOH additionnée.
Pour commencer, il faut ajuster la valeur du pH de l’échantillon (100 mL) à 8 à l’aide d’une solution d’hydroxyde de sodium à 1 N. 25 mL de formaldéhyde à pH 8 sont ajoutés, l’ensemble étant bien mélangé. La solution résultante est titrée jusqu’à pH 8 à l’aide d’une solution de soude à 0,1 N (volume V, versé, exprimé en mL).
Notons que le formaldéhyde utilisé est à 37 % mass. et qu’il est neutralisé à pH 8 à l’aide d’une solution de soude à 1N.
La concentration de l’azote assimilable est calculée comme suit : [azote assimilable] (mg/L) = V x 28
Cette méthode, qui consomme beaucoup de volume d’échantillon est réservée à des dosages sur des volumes non limités (non adaptée aux échantillonnages lors de suivi de fermentation).
6.2.2.2 – Dosages à l’aide de l’analyseur multi-paramétrique sélectif.
L’utilisation du MASCOTT Lisabio (Analyseur multi-paramètrique sélectif) permet lz détermination de la concentration en azote assimilable par mesures automatisées, basées sur des réactions enzymatiques ou chimiques quantifiables par spectrophotométrie. Dans le cas de l’azote assimilable, deux dosages sont considérés permettant de doser respectivement l’azote ammoniacal et azote alpha-aminé libre, principales formes d’azote assimilable par les levures dans les conditions
nologiques.
Pour ces deux dosages, l’appareil fonctionne en mode mono-réactif. Il réalise le prélèvement de l’échantillon. Une réaction est alors déclenchée dans une micro-cuve par adjonction d’un réactif. La mesure des densités optiques avant et après la réaction permet de déterminer la concentration recherchée à partir d’un étalonnage réalisé au préalable.
a – Azote Ammoniacal.
En présence de la déshydrogénase de glutamate (GIDH) et du dinucléotide nicotinamide- adénine réduit (NADH), l’ammoniac réagit avec le 2-oxoglutarate pour donner le L-glutamate. Le NADH s’oxyde alors en NAD+.
2-Oxoglutarate + NADH + NH4 +
L-glutamate + NAD+ + H2O
GIDH
La quantité de NADH oxydée dans la réaction ci-dessus est stoechiométrique à la quantité d'ammoniac. Le NADH est déterminé au moyen de son absorbance à 334, à 340 ou à 365 nm.
Le dosage de l’azote ammoniacal se fait avec un Kit enzymatique MicroDom comprenant : § 2 x 40mL de chromogène diluent
§ 2 x 20mL de chromogène § 2 x 50mL de solution blanc
§ 2 x 10mL de solution standard de 50mg/L de N-ammoniacal
Une programmation de l’analyseur prenant en considération l’ensemble des paramètres de la réaction enzymatique mise en jeu et les mesures spectro-photométriques considérées est mise en place. Le mono réactif employé est alors réalisé en mélangeant : 5 mL de solution chromogène et 20 mL de solution chromogène diluent (25 mL de ce réactif permettent le dosage de 20 échantillons).
Une droite étalon est réalisée à partir de 5 dilutions de la solution standard. Les échantillons sont alors dilués au besoin pour être cohérent avec cet étalonnage.
Pour une mesure test, le dosage de 5 répétitions d’un échantillon de jus de raisin donne : Azote ammoniacal : 103,3 mg/L, avec une erreur expérimentale de 5,2% et un écart type de 5,3 mg/L.
b – Azote alpha-aminé.
Les groupements azotés acides amines libres (NH3 +
) présents dans l’échantillon réagissent avec le N-acétyl-L-cystéine et l’ortho-phtaldialdéhyde pour former des dérivés iso-indole.
Azote alpha-aminé + N-acetyl-L-cysteine + o-phthaldialdehyde dérivés isoindole
La quantité de ces dérivés formés au cours de la réaction, déterminée par une mesure d’adsorbance à 340 nm, est proportionnelle à la teneur initiale en groupement aminé.
L’azote alpha-aminé est dosé à l’aide d’un kit Megaryme Primary Amino Nitrogen (K- PANOPA) comprennant :
§ 1 x 100 comprimés de borax et de N-acetyl-L-cysteine (NAC).
§ 160 mg de o-phthaldialdehyde (OPA; 160 mg) dans 12 mL d’éthanol (96 % v/v). § 1 x 5 mL de Solution standard d’isoleucine, correspondant à 140 mg/L d’azote aminé. Une programmation de l’analyseur prenant en considération l’ensemble des paramètres de la réaction mise en jeu et les mesures spectro-photométriques considérées est effectuée.
Le mono réactif employé est alors réalisé en mélangeant : 1 comprimé de borax/NAC, 3 mL d’eau distillée, 0,2 mL de solution d’OPA. (Le volume obtenu permet de doser 10 échantillons).
Une droite étalon est réalisée à partir de 5 dilutions de la solution standard d’isoleucine.
6.2.3 – Ethanol, acide acétique et glycérol.
Le dosage de ces différents composés est effectué par chromatographie liquide à haute pression (HPLC). L’appareil utilisé – TSP Spectra System – est équipé d’une colonne Aminex HPX-87H Ion Exclusion Column de dimension 300 x 7,8 mm spécifique pour la séparation des acides organiques et des alcools. Le liquide vecteur est une solution d’acide sulfurique de concentration 5 mM circulant à 0,40 mL.min-1. On travaille à 40 °C avec une boucle d’injection de 20 µL.
La détection des constituants se fait à l’aide d’un réfractomètre différentiel TSP RefractoMonitor I. L’intégration des pics et le traitement des données sont effectués grâce à un logiciel spécialisé (PCI 1000, Refracto).
Une corrélation entre la surface des pics obtenus et la concentration des différents constituants est mise en place pour chaque composé à partir de gammes étalon.
Pour ces constituants, les erreurs relatives sont estimées à moins de 5 % par rapport à des solutions standard.
6.2.4 – 4-éthyl-phénol.
6.2.4.1 – Principe général du dosage par MEPS/CPG.
Le dosage de composés volatils souvent à l’état de traces dans le vin peut s’effectuer par une méthode d’extraction préalable à une analyse chromatographique. La Micro-Extraction sur Phase Solide est une miniaturisation d’un tel procédé d’extraction sur phase solide. Cette nouvelle technique d'extraction gaz-solide ou liquide-solide, commercialisée depuis 1993, est le plus souvent couplée à la chromatographie en phase gazeuse (CPG) en vue de l'analyse des composés extraits. Cette méthode, qui n'utilise pas de solvant organique et ne nécessite qu'un très faible volume d'échantillon se décompose en deux étapes :
§ La première étape, d'extraction, (appelée phase d’Adsorption) se base sur un équilibre de partage entre une phase solide et une phase gazeuse (ou liquide). Cette phase solide est un film polymère (d’une longueur de 1 cm, d’une épaisseur de 7 à 100 µm) enrobant une fibre en verre de silice (d’un diamètre de 100 µm), l’ensemble étant protégé dans une aiguille creuse amovible. L'aiguille amovible a pour rôle de percer le septum du flacon contenant l'échantillon à analyser ; la fibre est alors déployée hors de l'aiguille et plongée, soit directement dans l'échantillon, à l’état liquide ou gazeux, soit au-dessus de l’échantillon (espace de tête) à l’état liquide et chauffé pour provoquer l’évaporation des composés d’intérêt. Les solutés se concentrent alors dans la phase solide polymère. La figure 03-6 illustre le montage alors employé.
§ La seconde étape consiste en la désorption thermique des solutés adsorbés. Pour ce faire, la fibre dans son aiguille/carter est plongée dans un injecteur CPG chauffé. Une fois dans l'injecteur, la fibre est à nouveau déployée hors de l'aiguille creuse protectrice et les molécules de solutés sont alors rapidement désorbées et transférées vers la colonne de CPG pour l’analyse. Ce système permet une analyse à la fois qualitative et quantitative.
Figure 03-6. Méthode MEPS : montage pour la phase d adsorption.
6.2.4.2 – Application au dosage du 4-éthyl-phénol.
Monje et al. (2001) montrent que cette technique donne des résultats très fiables en utilisant une fibre Polyacrylate 85 µm (Supelco®). Un système CPG Dani® GC1000TMmuni d’un Détecteur à Ionisation de Flamme (250 °C pour un mélange air/hydrogène) est utilisé avec une colonne capillaire polaire en polyéthylène glycol Alltech® EC-WAXTM (30 m x 0,32 mm x 0,25 µm). L’hélium à 1 mL/min est employé comme gaz vecteur.
La phase d’adsorption se déroule dans un flacon de 5 mL avec un septum en caoutchouc serti et contenant 2 mL d’échantillon à doser. 1 g de chlorure de sodium et 0,1 mL d’une solution de 3,4- diméthyl-phénol à 200 mg/L (étalon interne) sont ajoutés à l’échantillon. L’adsorption dans l’espace tête du flacon se déroule pendant 40 minutes, alors que l’échantillon est maintenu à 55°C avec une agitation constante à 800 rpm.
La désorption s’effectue dans la chambre d’injection à 250 °C pendant 5 minutes (en mode splitless).
Le programme thermique du four est le suivant : § 40 °C pendant 5 minutes
§ rampe à 10 °C/minutes pendant 14 minutes (passage de 40 à 180 °C) § rampe à 3 °C/minutes pendant 8 minutes (passage de 180 à 204 °C) § rampe à 10 °C/minutes pendant 3 minutes (passage de 204 à 234 °C) § 234 °C pendant 5 minutes.
Un double étalonnage est établi pour chaque type de milieu testé (les propriétés physico- chimiques régissant l’étape d’adsorption - équilibre liquide/gaz puis gaz/solide - dépendent en effet de la matrice considérée) :
§ [1-5 mg/L], avec 5 points : 1 – 2 – 3 – 4 – 5
§ [0 -1 mg/L] avec 6 points : 0 – 0,1 – 0,25 – 0,5 – 0,75 – 1
Selon les auteurs précédemment cités, l’erreur maximale est estimée à 6 %.
6.2.5 – Acide para-coumarique.
Le dosage de l’acide para-coumarique est réalisé par HPLC.
Après centrifugation de l’échantillon à 5 °C pendant 10 minutes à 12 000 tpm, le surnageant est filtré sur membrane à 0,45 µm. 20 µL sont alors injectés pour l’analyse, qui a lieu à l’aide d’un système – TSP Spectra System – équipé d’une colonne Sherisorb S5-ODS2 (Phase Sep). La phase mobile est constituée d’eau ultra pure, d’acide formique et d’acétonitrile. Un détecteur UV (TSP Spectra Series UV150) à longueur d’onde variable est employé pour déterminer l’absorbance en sortie de colonne. L’intégration des pics et le traitement des données sont réalisés à l’aide du logiciel PCI 1000 UV.
Une gamme étalon est établie entre 0 et 6 mg/L d’acide para-coumarique dissous dans une solution aqueuse à 10 % vol/vol en éthanol.
Remarque importante :
Des travaux de Salaméh et al. (Communication interne au laboratoire relatif à des travaux en cours et à paraître) ont permis l optimisation des conditions opératoires de cette méthode initialement proposée par O neill et al. (1996). Nous ne détaillerons donc pas ici ces conditions de travail préconisées dans ces nouveaux travaux (composition et débit de l éluant, programme thermique, longueur d onde du détecteur).
6.3 – Mesure d’Oxygène dissous.
La mesure d’oxygène dissous est réalisée à l’aide d’un oxymètre muni d’une sonde immergeable à capteur LDO à mesure optique (Luminescent Dissolved Oxygen) : HQ10 Hach Portable LDOTM.
La teneur en O2 est déterminée par une couche sensible qui réagissant à la lumière bleue renvoie
une lumière rouge : phénomène de luminescence. Le temps entre l’émission et le retour est corrélé à concentration en oxygène (figure 03-7), dans des conditions données de température et de pression.
Figure 03-7. Principe de la mesure d oxygène par capteur LDO.
Une calibration à 100 % de la saturation dans l’eau est nécessaire. Le résultat est alors fourni en % de saturation ou concentration exprimée en mg/L. La précision de l’appareil est estimée par le constructeur à ± 0,1 mg/L (La corrélation « % de la saturation / concentration en mg/L » dans l’eau est fournie en Annexe 03)
L’acquisition peut se faire de manière ponctuelle/instantanée ou moyennée sur différentes durées : 30 s, 1 minute, 2 minutes et 5 minutes. Du fait du montage utilisé pour la culture (emploi d’un incubateur à table agitante), et afin d’intégrer le temps de mise en régime et de stabilisation du système nous optons pour une moyenne sur 5 minutes.
Au cours de la culture plusieurs mesures d’oxygène dissous sont effectuées aux différents moments clé de la croissance. La sonde utilisée n’étant pas stérile et n’étant pas stérilisable, nous menons une fermentation pour une souche donnée, dans des conditions données, dans une batterie d’erlenmeyers identiques conduits en parallèle (même milieu, même volume, même inoculum). Ainsi, une mesure effectuée à un moment donnée se fait dans un erlenmeyer qui est alors « sacrifié » (principe de suivi d’une fermentation unique dans des cultures suicides en parallèle).