Une série de 37 souches, isolées grâce à cette procédure a été soumise à l’identification génétique (chapitre 03, §3.5) et 35 ont été effectivement identifiées comme appartenant à l’espéce B.
bruxellensis.
Malheureusement, le travail génétique n’a pas été approfondi sur les deux souches non
Brettanomyces ayant passé avec succès les tests de la procédure. Mais les récents travaux de Dias et al.
(2003(b)) ainsi que Martorell et al. (2006) laissent à supposer qu’il pourrait s’agir de souches de
Nous retenons donc qu’une très faible proportion d’isolats considérés comme Brettanomyces ne l’étaient pas effectivement. Isolats qui au demeurant présentent des caractéristiques proches pour ne pas dire similaires à celles de Brettanomyces bruxellensis, impliquant notamment des détériorations du produit. Elles devront donc être également au coeur des préoccupations dans la pratique.
2 – Influence de la durée de la première étape : activation et enrichissement.
Nous nous sommes par ailleurs plus particulièrement intéressés à la durée nécessaire de la première étape de la démarche retenue, en fonction du type d’échantillon considéré.
En effet, nous pouvons supposer que dans ces différents contextes de prélèvement (sur le raisin, dans les moûts, les vins finis, sur le matériel) Brettanomyces si elle est présente, ne l’est pas de manière équivalente d’un point de vue quantitatif : pouvant variant de quelques cellules par kg de vendange ou cm² de surface sale, à plusieurs milliers de cellules par mL de vin.
Lorsque nous commençons nos travaux en 2003, aucune indication réelle n’est fournie sur l’intérêt et la nécessité d’une telle procédure pour des échantillons de nature diverse. Par la suite, Renouf et Lonvaud (2006(b)) montrent par exemple qu’une pré-culture de 10 jours en milieu liquide spécifique est nécessaire avant qu’un test génétique ne permette de dépister la présence du contaminant dans un échantillon de vendange. Cet enrichissement est alors une étape qui permet de développer un nombre suffisant de micro-organismes pour passer au delà la limite de détection des méthodes en aval, dans leur cas différentes méthodes PCR. A titre indicatif, le meilleur seuil de détection de PCR est proposée actuellement dans la bibliographie par Phister et Mills, 2003 : 1 cellule par mL.
N’utilisant pas systématiquement de méthode génétique dans notre démarche, mais des approches simples de microbiologie classique tels que les étalements sur milieux spécifique, notre seuil de détection serait par exemple, si l’on travaillait en étalement direct d’1 mL par boite de 1 UFC/mL (seuil réduit à 2 UFC/mL pour un étalement de 0,5 mL et ainsi de suite). Dès lors, tout échantillon présentant une population inférieure à ce seuil apparaîtrait négatif aboutissant alors à une sous-évaluation la présence réelle du contaminant.
De plus, l’environnement viti-vinicole rassemblent des conditions pouvant engendrer des situations de stress vis-à-vis des micro-organismes (notamment : alcool, SO2). Or Millet et Lonvaud
(2000) montrent que dans certaines conditions, des bactéries, mais également des levures, dont le genre Brettanomyces, sont capables de survivre dans un état physiologique particulier de Cellules Viables mais Non Cultivables (VNC). Il s’agit de cellules vivantes, pourvues d’activités métaboliques diverses, mais incapables de se développer sur des milieux solides de dépistage. Dès lors la présence de micro-organismes dans cet état est indétectable par des voies classiques de microbiologie
(étalement sur gélose) et peut aboutir à une conclusion erronée quant à la contamination. Ces mêmes auteurs montrent, dans le cas de VNC induites par sulfitage, qu’une culture en milieux liquides nutritifs de plusieurs jours peut permettre de modifier cet état physiologique des cellules et d’aboutir à des levures pouvant à nouveau croître sur gélose. Ainsi, une étape d’activation, voire de ré-activation, devient nécessaire.
De ce fait, la première étape de notre procédure joue ce double rôle : d’activation/réactivation afin de rendre les éventuels micro-organismes présents Cultivables et détectables par la culture sur milieux solides tests, mais également d’enrichissement, afin de fournir un nombre suffisant de ces micro-organismes pour dépasser le seuil de détection.
Nous pouvons par ailleurs supposer que cette durée est significative d’une phase d’adaptation des micro-organismes lors de leur passage d’un milieu naturel (baie de raisin) à un milieu de culture (milieu liquide).
Le travail qui suit est donc mené pour adapter cette étape clé en se plaçant dans les différents cas de figures d’échantillons envisagés dans le contexte nologique.
2.1 – Description générale de l’expérimentation.
Plusieurs prélèvements représentatifs d’un type d’échantillons donnés sont soumis au dépistage. Après différentes durées d’enrichissement initial, une observation au microscope permet d’apprécier le développement ou non de levure. Les résultats sont alors notés :
§ Obs + : lorsqu’on observe un quelconque développement de levures dans le milieu
d’enrichissement
§ Obs - : lorsque aucun développement levurien n’est observé. Mais cela ne signifie pas
dans l’absolu l’absence totale de micro-organisme, mais seulement à un niveau inférieur au niveau détectable par l’observation (moins de 1 cellule dans le volume présent entre la lame et la lamelle utilisée).
Pour chaque échantillon, 0,5 mL de ce milieu enrichi sont étalés sur milieu MSBT pour le double test : acidité + conversion de l’acide para-coumarique. Les résultats de ce test sont notés :
§ + : lorsque les deux tests sont positifs : présence d’au moins une levure acidifiante ET productrice d’odeur caractéristique de la métabolisation de l’acide p-coumarique. § - : lorsqu’au moins un des deux tests est négatif.
Ce résultat au double test sert alors de conclusion sur le dépistage : « + » signifie alors Présence de Brettanomyces dans l’échantillon et « - » en notifie l’absence.