Dosage des composés extracellulaires

Le dosage des EPS présents à la surface de la membrane isopore au sein du dépôt bactérien formé après une étape de microfiltration a été réalisé au sein du LBAE9_. Le protocole utilisé est composé de deux étapes séquencées (Simon et al., 2009): une première phase d’extraction qui consiste à détacher et isoler les EPS présents dans le dépôt bactérien, suivie d'une phase d'analyse par chromatographie d’exclusion stérique qui permet de déterminer la composition relative et d'identifier les molécules en présence. Le protocole mis en œuvre est adapté depuis la littérature (Bourven et al., 2012; Ras et al., 2011).

a. Extraction

Afin de détacher le dépôt de bactéries présent à la surface de la membrane isopore, des sections sont découpées en condition stérile à l’aide d’instruments propres pour être placées ensuite dans un tube. L’échantillon de membrane est immergé dans un volume fixe de tampon PBS (2 mL). Le mélange est agité pendant 1 min à l’aide d’un vortex afin de resuspendre dans le milieu les bactéries déposées sur la membrane. La totalité du volume (2 mL) est ensuite prélevée pour être centrifugée pendant 10 min à 3000 g, le

9 _{Laboratoire de Biotechnologies Agroalimentaire et Environnementale (LBAE) - IUT A Paul Sabatier site}

83 surnageant est éliminé. Le culot de cellules est suspendu dans 1 mL de tampon PBS puis la suspension est soumise à des ultrasons (20 kHz) pour 5 cycles de 30 sec dans le but de lessiver les bactéries sans pour autant entrainer la lyse des cellules. Enfin, la suspension subit une dernière étape de centrifugation pendant 10 min à 5000 g, étape qui permet de fractionner les cellules (culot) du milieu (surnageant) qui contient les EPS. Alors, le surnageant est prélevé pour l'analyse chromatographique.

b. Analyse par Chromatographie d’exclusion stérique

L’appareillage utilisé pour réaliser la chromatographie est un Acta purifier 10 (GE Healthcare) couplé à deux détecteurs en série (UV-visible et fluorescence) afin d’affiner l’identification des molécules détectées. Sur cet appareil, la colonne du chromatographe est en réalité l’assemblage de deux colonnes de filtration sur gel Superdex 75 et Superdex 200 (GE Healthcare). La première colonne Superdex 200 permet de séparer les molécules de poids moléculaires comprises entre 5000 et 1 000 000 Da. Dans cette première colonne, la phase mobile est du tampon PBS circulant à 0,75 mL.min-1_{. La seconde colonne Superdex 75 GL permet, ensuite, de} séparer les molécules de poids moléculaires plus petites comprises entre 1000 et 200 000 Da. Dans cette seconde colonne, la phase mobile est du tampon PBS circulant à 0,4 mL.min-1_{. En entrée, un volume de 500 µL du surnageant, obtenu grâce au} protocole d’extraction, est injecté dans le système.

Protéine Masse moléculaire (Da)

Thyroglobuline 669000 Ferritine 440000 Conalbumine 75000 Carbonic anhydrase 29000 Ribonucléase A 13700 Thyrotropine 362

Figure II.6: Protéines étalons utilisées pour la calibration de deux colonnes en série Superdex 75 et Superdex 200.

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Les molécules éluées sont révélées en sortie de colonnes grâce aux UV à deux longueurs d’onde (210 et 280 nm) mais aussi par fluorescence avec le couple d’excitation/émission fixé à 221 / 350 nm utilisé pour la détection des protéines en sortie de chromatographie. La détermination des poids moléculaires des entités séparées est effectuée par comparaison avec une droite de calibration établie avec des protéines étalons de tailles connues (cf. Figure II.6). La courbe de calibration alors obtenue (log (MM) = -0,1714.Ve + 8,9857) permet de relier le poids moléculaire (en Da) au volume d’élution (en ml) pour les molécules détectées à 280 nm. Les profils de chromatographie sont enregistrés et analysés à l’aide du logiciel Unicorn 5.1 (GE Healthcare).

Conclusion

Ce chapitre décrit le matériel et les méthodes nécessaires à l’étude des mécanismes de transfert des bactéries à travers les pores d'une membrane de filtration. Ainsi, en plus des techniques classiquement employées en microbiologie et génie des procédés membranaires, cette étude a nécessité la mise en œuvre des techniques destinées à l’observation des cellules biologiques à différentes échelles afin d'analyser leurs propriétés morphologiques.

Chapitre III Caractérisation des membranes

modèles et des suspensions bactériennes

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Introduction

L’étude des mécanismes de transfert mis en jeu au cours d’une filtration requiert la maitrise des conditions opératoires appliquées mais, également, une caractérisation fine des différentes fractions qui composent le fluide à traiter (liquide/solide), ainsi qu'une bonne connaissance du matériau filtrant. Ce chapitre s’intéresse donc d’une part à la description des membranes sélectionnées et, d’autre part aux caractéristiques morphologiques des particules biologiques présentes en suspension.

Dans une première partie, les caractéristiques structurales des membranes isopores seront présentées, leur perméabilité et leur distribution de tailles de pore seront déterminées. Dans une deuxième partie, les trois souches de microorganismes sélectionnés seront étudiées à différentes échelles afin d’analyser la forme, la taille et la rigidité des cellules bactériennes. Puisque la composition physico-chimique du fluide à traiter est susceptible d'influencer la morphologie et la viabilité des cellules en suspension, le milieu dispersant témoin sélectionné pour nos travaux est constitué d’une solution de chlorure de sodium dans de l'eau ultra pure à une concentration de 9 g/L qui permet d'assurer le maintien des cellules vivantes en condition physiologique iso-osmotique. Les effets d’une exposition à un antibiotique sur les bactéries modèles seront également évalués à l’aide des différentes techniques d’observation mises en œuvre pour la caractérisation des suspensions bactériennes.

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Partie A. Etude des membranes isopores

Afin d'étudier les mécanismes de transfert des bactéries à travers les pores d'une membrane à l'échelle submicronique, nous avons sélectionné les membranes isopores comme modèle pour nos travaux. Ces membranes possèdent de nombreuses caractéristiques qui en font un outil de choix vis-à-vis de notre problématique (Apel, 2001; Tung and Chuang, 2002):

 Taille de pore calibrée

 Pores uniformes, cylindriques et de même longueur  Surface plane

Grâce à ces propriétés uniques, les membranes isopores sont utilisées depuis de nombreuses années pour l'étude des phénomènes de transport d'une grande variété de particules au cours d'une filtration: des bactérie (Delebecque et al., 2006; Suchecka et al., 2003; Xu and Chellam, 2005) ou de virus (Urase et al., 1996) mais aussi de particules artificielles (Long et al., 1981; Patil et al., 2013), de protéines (Tracey and Davis, 1994), d'ions (Grzywna et al., 1996)... Néanmoins, différents travaux soulignent l'impact des irrégularités comme les variances de formes des pores, l'existence de pores multiples ou encore d'une distribution de tailles de pore (répartition autour d'une valeur moyenne): ces défauts peuvent altérer la