Le domaine transmembranaire de la triadine est nécessaire pour sa bonne

Au vu de la capacité de T95∆Cter de se localiser à la triade dans des myotubes matures, nous nous sommes demandés si le domaine N-terminal ou transmembranaire (TM) de ce mutant étaient importants pour son ancrage.

Nous avons donc créé des hybrides, en échangeant les domaines N-terminaux et TM de T95∆Cter et Sec61β, couplés à une PAGFP (Figure R38A):

- Sec61^N-T95 : contient le N-terminal de la triadine et les TM et C-terminal de Sec61β - Sec61^TM-T95 : contient les domaines N et C-terminaux de Sec61β et le domaine TM de la triadine

- T95∆CterTM-Sec61 : contient les domaines N et C-terminaux de T95∆Cter ainsi que le domaine TM de Sec61β.

192 Nous avons vérifié la bonne expression de ces différents hybrides par Western blot, une fois transduits dans des cellules TRDN KO. Les protéines contenues dans les lysats cellulaires ont été analysés en Western blot avec un anticorps anti-GFP. Les résultats ont permis de détecter des bandes autour de 37-40 kDa (Figure R38B) : celles correspondant à T95∆Cter, Sec61TM-T95

et T95∆CterTM-Sec61

sont aux tailles attendues. Par contre Sec61^N-T95 présente deux bandes, l’une à 40 kDa et l’autre à 25 kDa (Figure R38B flèches jaune et verte). Or, la protéine devrait migrer vers 35 kDa ce qui ne correspond pas au profil observé. De plus, T95∆CterTM-Sec61

et Sec61

N-T95 semblent présents en des quantités moins importantes que T95∆Cter et Sec61 TM-T95.

Un deuxième Western blot a été réalisé avec un anticorps anti domaine N-terminal de la triadine (Figure R3 C). Tout d’abord une bande non spécifique apparaît avec cet anticorps pour toutes les protéines testées (flèche bleue). Ensuite et comme attendu cet anticorps reconnaît bien T95∆Cter et T95∆CterTM-Sec61

qui contiennent la partie N-terminale de la triadine et ne reconnaît pas Sec61^TM-T95 qui contient le N-terminal de Sec61β. Concernant Sec61N-T95

une seule bande est apparue autour de 40 kDa (Figure R38C, flèche jaune). Cette bande représente donc bien notre hybride, même s’il est présent en faible quantité et à un poids moléculaire supérieur à ce qu’on attendait (40kDa au lieu de 35kDa). La bande à 25 kDa (flèche verte) détecté dans le Western blot précédant n’est pas observée avec l’anticorps anti-N-terminal de la triadine, suggérant que cette bande représente surement une PAGFP seule. Pour une raison dont nous ne connaissons la cause, l’hybride Sec61N-T95

est présent dans les cellules sous la forme d’une PAGFP seule en plus de l’hybride en tant que tel.

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Figure R38 : Les différents mutant et hybrides utilisés. (A) Schéma représentant T95∆Cter-PAGFP, Sec61^N-T95-PAGFP, Sec61^TM-T95-PAGFP et T95∆CterTM-Sec61

-PAGFP avec leurs domaines N-terminaux (N), C-N-terminaux (C) et transmembranaires (TM) ainsi que la localisation de chaque domaine vis-à-vis de la membrane du RS (Cytoplasme, Membrane (Mb) et Lumière du RS). Les chiffres noirs indiquent le nombre d’acides aminés de la protéine. (B) Western blots réalisés avec un anticorps anti-GFP sur 10 µg de lysats cellulaires TRDN KO transduits avec T95∆Cter-PAGFP ou Sec61^N-T95-PAGFP ou Sec61^TM-T95-PAGFP ou T95∆CterTM-Sec61-PAGFP. L’anti-GFP détecte des bandes autour de 40 kDa pour T95∆Cter et T95∆CterTM-Sec61

, à 37 kDa pour Sec61^TM-T95 ainsi que deux bandes à 40 kDa (flèche jaune) et 25 kDa (flèche verte) pour Sec61^N-T95. (C)Western blots réalisés avec un anticorps anti-N-terminal de la triadine sur 10 µg de lysats cellulaires TRDN KO transduits avec T95∆Cter -PAGFP ou Sec61N-T95

-PAGFP ou Sec61^TM-T95-PAGFP ou T95∆CterTM-Sec61

-PAGFP. L’anticorps détecte seulement des bandes pour T95∆Cter, Sec61N-T95 et T95∆CterTM-Sec61

.

Une seule bande à 40 kDa (flèche jaune) est détectée pour Sec61^N-T95 alors que la bande à 25 kDa (flèche verte) a disparu, indiquant qu’elle ne contient pas la partie N-terminale de la triadine. Des bandes non spécifiques (flèche bleue) sont également détectées avec cet anticorps.La β-tubuline a été utilisée comme contrôle de charge.

La localisation de ces hybrides a également été étudiée à DIF9 grâce à des immunomarquages afin de pouvoir comparer leurs localisations à celle de T95∆Cter, étant donné qu’à ce stade T95∆Cter se localise à la triade.

La colocalisation de T95∆Cter avec RyR1 a été quantifiée, elle atteint 0% de la colocalisation T95/RyR1, illustrant que T95∆Cter à DIF9 est bien localisée à la triade. En comparaison la colocalisation de Sec61β avec RyR1 atteint la valeur de 55% de la colocalisation T95/RyR1. Cette valeur bien qu’élevée est due au marquage diffus de Sec61β dans les cellules (Figure R39).

194 Concernant les hybrides, Sec61^N-T95 montre un marquage diffus ne colocalisant pas avec RyR1 et présentant donc un pourcentage de colocalisation avec RyR1 similaire à celui de Sec61β. T95∆CterTM-Sec61 s’accumule dans de petits clusters différents de ceux de RyR1. Son pourcentage de colocalisation est lui aussi similaire à celui de Sec61β. Sec61TM-T95

forme des doubles rangées de points qui colocalisent avec RyR1, à hauteur de 75% de la colocalisation T95/RyR1 et de façon similaire à la colocalisation de T95∆Cter avec RyR1 (Figure R39).

Figure R39 : Le domaine transmembranaire de la triadine est nécessaire pour sa localisation à la triade. (A) Myotubes à DIF9 transduits avec T95∆Cter-PAGFP, Sec61N-T95

-PAGFP, Sec61^TM-T95 -PAGFP et T95∆CterTM-Sec61

-PAGFP et immunomarqués avec un anti-GFP (vert) et un anti-RyR1 (magenta). Barres d’échelle = 5 µm et 2 µm pour les zooms. (B) Pourcentage de colocalisation de chaque construction PAGFP avec RyR1 et normalisé au pourcentage de colocalisation de T95 avec RyR1 à DIF9. Les valeurs représentent les moyennes ± i.c. n = 21 à 40 cellules analysées de 2 à 4 expériences indépendantes. One-way ANOVA : $ = comparaison avec Sec61β : T95∆Cter (p<0,0001) et Sec61^TM-T95 (p<0,05) ; # comparaison avec T95∆Cter (p<0,0001).

195 Les Western blot ont permis de nous rendre compte que l’hybride Sec61N-T95

semble s’exprimer dans les cellules en culture sous la forme d’une GFP seule en plus de l’expression spécifique de l’hybride. De plus, les immunomarquages montrent que l’hybride est présent sous forme diffuse dans toute la cellule. Ce résultat mêlant localisation de la GFP en plus de celle de l’hybride rend la conclusion dure à tirer quant au rôle de la partie N-terminale de la triadine sur son ancrage à la triade. Néanmoins, aucune accumulation particulière à la triade n’est observée avec cet hybride, laissant supposer que la partie N-terminale de la triadine n’aurait pas un rôle primordial sur sa localisation à la triade.

D’autre part, T95∆CterTM-Sec61 ne se localise pas à la triade alors que l’hybride Sec61^TM-T95 présente un marquage triadique spécifique en doubles rangées de points, illustrant le fait que le domaine TM de la triadine est nécessaire à sa localisation à la triade.