Diversité chimique des souches de Paraburkholderia

6.2.2.1. Analyses des profils UHPLC-MS/MS

Cette classification en différents taxons, proposée par l’analyse des empreintes protéiques des souches de Paraburkholderia, peut être corrélée à leur diversité chimique.

Les analyses UHPLC-MS/MS des extraits AcOEt utilisés lors du criblage biologique ont été réalisées à l’Université de Genève. Les profils métabolomiques (Annexe S26) ont été comparés suivant la répartition des souches donnée par les empreintes protéiques. Nous avons pu observer les éléments suivants :

- les souches de Paraburkholderia sp.1, sp.4 et sp.6 produisent peu de métabolites ou du moins en faible quantité dans nos conditions de culture. En effet, leurs profils UHPLC-MS/MS sont identiques à celui de l’extrait à l’AcOEt du milieu de culture,

- les Paraburholderia sp.3 et sp.7 produisent des métabolites en commun, différents des souches précédentes. De plus, l’extrait de Paraburkholderia sp.3 contient également des molécules plutôt apolaires de masse importantes (ex : m/z 1068,47 et 1154,518), donc présente une certaine spécificité,

- l’extrait Paraburkhoderia sp.5 présente un pic majoritaire à m/z 206,153,

334 Patel N. M., Moore J. D., et al., Identification of unanticipated and novel N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) using a sensitive non-targeted LC-MS/MS method. PLOS ONE 2016, 11, p. e0163469.

113 - les souches de Paraburkholderia sp.8 quant à elles, partagent le même profil

UHPLC-MS/MS, différent des autres espèces.

Ces analyses et la comparaison des spectres permettent de corréler la classification taxonomique des souches avec leurs profils chimiques.

6.2.2.2. Analyse du réseau moléculaire regroupant les données UHPLC-MS/MS des

extraits de Paraburkholderia

Après retraitement des données MS/MS de ces extraits par le logiciel MZmine 2, un réseau moléculaire contenant 7786 nœuds a été calculé par le logiciel MetGem (Figure VI. 5).

La déréplication de ce réseau par comparaison avec les spectres de fragmentation disponibles dans les bases de données MS/MS permet de retrouver au moins huit clusters contenant des molécules analogues aux AHLs. De plus, les fragments caractéristiques des AHLs (Figure VI. 4) sont bien présents dans les spectres MS/MS des nœuds de ces clusters. Les nœuds relatifs aux AHLs isolées de BSNB-0656 (Parabukholderia sp.2) sont retrouvés grâce à la mesure de leur masse en haute résolution (Figure VI. 5).

Figure VI. 5. Réseau moléculaire construit avec les données UHPLC-MS/MS des 22 extraits AcOEt de

Paraburkholderia sp. La quantification relative de chaque ion dans les extraits est représentée par une

répartition en secteur du nœud suivant l’intégration du signal XIC. Les clusters encadrés sont formés de nœuds possédant des signaux de m/z caractéristiques aux AHLs sur leur spectre de fragmentation.

Sept de ces clusters présentent des nœuds retrouvés dans les extraits des souches de Paraburkholderia sp.2 BSNB-0656, -0658 et -0661 précédemment étudiés et Paraburkholderia

114 sp.8 (nœuds en vert et en jaune). Le dernier cluster est partagé entre les extraits de Paraburkholderia sp.3 et sp.8, et montre des nœuds spécifiques à l’extrait de la souche BSNB-0648 (Paraburkholderia sp.3). En plus des fragments caractéristiques retrouvés sur les spectres de fragmentation des AHLs (m/z 102,055, 74,061 et 56,050), ces derniers sont également composés d’un pic à m/z 120,066 (Figure VI. 6). D’après la littérature, ces nœuds pourraient correspondre à des AHLs hydrolysées avec l’ouverture du cycle de la lactone.Erreur ! Signet non défini. Le pic de m/z 102,055 observé dans les spectres de fragmentation des AHLs hydrolysées est caractéristique du cycle lactone fermé et peut s’expliquer par sa reformation durant la fragmentation dans le spectromètre de masse.

Figure VI. 6. Cluster de nœuds analogues d'AHLs spécifiques aux Paraburkholderia sp.2 (BSNB-0656, -0658, -0661) et Paraburkholderia sp.3 et sp.8. Les spectres de fragmentation sont associés à quatre nœuds, présentant un pic à m/z 120,066.

Des nœuds sont spécifiques aux extraits des souches de l’espèce Paraburkholderia sp.5. Nous retrouvons notamment le nœud à m/z 206,153, signal majoritaire des profils UHPLC de cette espèce. En comparant avec les bases de données de spectres MS/MS, le spectre de fragmentation de ce nœud est proche d’un ion dérivé de phényléthylamide à m/z 276,231 avec des signaux en commun à m/z 122,096, 105,070 et 103,055 sur le spectre de fragmentation. La formule brute prédite pour un ion [M+H]+ à m/z 206,153 est C13H19NO (calc. 206,1539, err. -3,51 ppm), pouvant correspondre à un dérivé de phényléthylamide. Compte tenu de toutes ces données, nous pouvons supposer que ce métabolite est la N-(2-phényléthyl)pentanamide, permettant également d’expliquer le fragment à m/z 85,065 (Figure VI. 7). De même, d’après les spectres de

115 fragmentation et la déréplication avec les bases de données, un ion à m/z 245,164 peut correspondre à la N-(2-(1H-indol-3-yl)éthyl)pentanamide comportant un motif tryptamine (Figure VI. 8). D’après la formation des clusters dans le réseau moléculaire, des analogues de ces molécules seraient également produites par cette espèce (Figure VI. 9). D’autres clusters spécifiques à cette espèce sont présents dans le réseau, mais la déréplication n’a pas permis d’identifier des structures proches de ces clusters à partir des bases de données.

Figure VI. 7. Spectre de fragmentation et prédiction de la molécule associée au nœud à m/z 206,153.

116 Figure VI. 9. Nœuds spécifiques à Paraburkholderia sp.5 avec prédiction de dérivés de phényléthylamide.

En conclusion, nous observons des variations dans la diversité chimique des souches suivant la discrimination en espèces obtenue par l’analyse MALDI-TOF MS de leur empreinte protéique. Le réseau moléculaire, obtenu avec les données UHPLC-MS/MS des extraits AcOEt, indique la présence d’AHLs dans les extraits de Paraburkholderia sp.3 et sp.8. Le pic majoritaire de l’extrait de Paraburkholderia sp.5 à m/z 206,153 semble correspondre à la N-(2-phényléthyl)pentanamide, d’après la masse haute résolution et son spectre de fragmentation MS/MS.

Les extraits AcOEt des souches de Paraburkholderia sp.8 montrent une activité QQ sur Chromobacterium violaceum CV026. L’activité QQ des AHLs, métabolites majoritaires dans ces extraits, est alors mesurée.