DISCUSSION ET PERSPECTIVES

Afin de tester notre hypothèse selon laquelle le blocage de l'interaction entre la protéine de la coiffe et la protéine de l'aiguille pourrait avoir un impact sur la virulence des bactéries, nous avons développé des anticorps monoclonaux contre ces zones supposées et les avons utilisés en immunothérapie passive contre des infections à S. Typhimurium ou S. flexneri. Nous avons souhaité également évaluer la possibilité d'utiliser ces anticorps comme protéines porteuses des antigènes, afin d'induire une réponse immunitaire permettant ensuite une protection de type vaccinal comme cela a pu être précedemment décrit (et observé au laboratoire) pour la ricine, toxine de plante.

Les différentes immunisations réalisées ont permis d’obtenir des AcMs capables de reconnaître leur cible sous forme recombinante par immunoblot et par test immuno-enzymatique. Puisque ces AcMs sont dirigés contre les régions conservées de ces protéines, un même AcM est capable de reconnaître deux protéines présentant des identités de séquence (PrgI et MxiH d’une part, SipD et IpaD d’autre part).

L’« epitope mapping » de deux AcMs anti-IpaD/SipD capables d'être partiellement protecteurs in vivo(IpaD-301 et IpaD-318),n’a pas permis de définir de régions épitopiques. Bien que ces AcMs fonctionnent en immunoblot, il est probable que ces deux anticorps reconnaissent un épitope non linéaire. En effet, cette technique ne permet pas une dénaturation complète de la protéine recombinante, comme on peut le voir par exemple pour IpaD pour laquelle les interactions non covalentes entre les molécules ne sont pas complètement abolies par le SDS et le chauffage, et qui sont visibles par la présence de multimères (dimères ou trimères, migrant à la taille attendue de 75 et 110 kDa, voir figure 50). Il est donc possible que pour cette raison ces anticorps qui fonctionnent en immunoblot, ne fonctionnent pas en « epitope mapping ». Une autre possibilité est que les paramètres choisis pour la synthèse des séquences peptidiques (9 acides aminés avec un décalage de 2 acides aminés entre chaque spot) ne permettent pas de révéler de façon optimale les épitopes reconnus par les AcMs. Néanmoins il est communément admis qu'un épitope linéaire est constitué à minima de 5 à 6 résidus. Cela signifierait donc que pour ces anticorps, les épitopes seraient plus longs que 9 résidus. D'autre part, il serait intéressant de tester les anticorps polyclonaux présents dans les plasmas des souris immunisées en« epitope mapping » afin de déterminer les régions les plus immunogènes (épitopes T) et de préciser leurs positions sur la séquence de la protéine recombinante. Ces analyses pourraient être réalisées aussi avec les AcMs anti-MxiH/PrgI et pourraient nous fournir des informations importantes sur les AcMs reconnaissant les protéines de l’aiguille de l’injectisome. La détermination des épitopes de reconnaissance des anticorps anti-IpaD/SipD et anti-MxiH/PrgI ayant échoué par pepscan, elle pourrait être réalisée par une autre technique(mutagénèse dirigée par exemple) et pourrait permettre d’expliquer le mécanisme de neutralisation des AcMs. En effet, cette

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neutralisation peut être effectuée soit par blocage direct de l'association hétérologue des protéines (PrgI-SipD et MxiH-IpaD) ou homologue en bloquant la multimérisation des protéines (par exemple SipD-SipD pour former le pentamère), soit d'une façon plus indirecte par encombrement stérique ou soit par opsonisation.

Pour des études ultérieures, il pourrait être intéressant de produire des AcMs contre les protéines formant le translocon de l’injectisome : SipB/SipC et IpaB/IpaC respectivement de Salmonella et Shigella et qui présentent des identités de séquences. Ces protéiness’insèrent dans la membrane cytoplasmique de la cellule hôte pour former des pores permettant le passage des protéines effectrices sécrétées par les bactéries(296). Comme mentionné précédemment, IpaB a déjà montré son efficacité en vaccination contre des infections à S. flexneri. On peut supposer que des anticorps dirigés contre cette protéine pourraient avoir un effet protecteur. A l'heure actuelle, et à notre connaissance, il n'existe pas d’anticorps anti-translocon développés dans cet objectif.

Une autre cible possible pourrait être la protéine du socle de l'injectisome (InvG de Salmonella et MxiD de Shigella), sur laquelle repose l'échafaudage moléculaire de l'aiguille. On pourrait imaginer que des anticorps reconnaissant cette protéine empêchent la fixation de la protéine constitutive de l'aiguille. Il apparaît cependant difficile de produire des anticorps reconnaissant la protéine native à partir d’une immunisation utilisant la protéine recombinante entière (d’après des travaux réalisés au laboratoire sur la protéine homologue chez YersiniaYscC). En effet, ces protéines sont localisées dans la membrane externe deSalmonella et Shigella exprimant l’injectisome. En 2013, il a été montré qu’YscC se présente sous forme de dodécamère et seule une faible proportion de la protéine est exposée à la surface de la bactérie sous forme d’un anneau (298). Une comparaison du complexe YscC avec celui de S. Typhimurium (248) et S.flexneri(299)a montré une similarité de structure importante entre les différentes protéines formant le socle(300). La partie accessible aux AcMs serait donc très limitée, et probablement enfouie dans le LPS des bactéries, ce qui limite encore davantage l'accès des anticorps.

Les analyses combinatoires nous ont servi à évaluer la capacité de liaison de nos anticorps (par paires, ayant donc des épitopes compatibles) aux protéines recombinantes SipD et IpaD et a permis la sélection des AcMs capables de reconnaître les deux protéines, donc des épitopes communs aux deux protéines. Dans la série d’AcMs anti-IpaD/SipD, une grande majorité d’AcMs utilisés en combinaison sont capables de reconnaître la protéine recombinante IpaD à différentes concentrations alors que certains d’entre eux ne sont pas capables de détecter la protéine recombinante SipD, bien que les anticorps aient été sélectionnés pour leurs capacités à reconnaître les deux protéines. Cela s'explique par le fait que la sélection des anticorps est réalisée de façon relativement binaire (reconnaissance/non-reconnaissance), sans mesure d'affinité. Il est alors possible de sélectionner des anticorps, qui bien que reconnaissant la protéine SipD, présentent une affinité moindre que pour IpaD, l'immunogène utilisé.Il

181 est donc nécessaire de caractériser plus finement les AcMs, en particulier leur affinité qui peut influencer le choix des anticorps pour l'immunothérapie.

Les combinaisons constituées d'AcMs reconnaissant le même épitope (AcM identique en capture et en traceur ou AcMs du même groupe de compatibilité) ne devraient pas reconnaître simultanément la protéine recombinante. C’est pourtant le cas à une concentration élevée d’IpaD et de SipD pour certaines combinaisons. Cela confirme ce qui a été observé en immunoblot, à savoir que les protéines recombinantes oligomérisent naturellement, ce qui permet à certaines combinaisons d’AcMs, à priori non compatibles, de les détecter. Il serait maintenant important de confirmer ques les AcMs sont capables de détecter la protéine native (IpaD ou SipD) sécrétée par la bactérie. Pour ce faire, il faudrait induire in vitro la production du SST3 de Salmonella et Shigella et tester dans ces conditions la reconnaissance par les AcMs. Concernant les AcMs anti-MxiH/PrgI, les analyses combinatoires n'ont pas encore été effectuées. De même que pour IpaD et SipD, il serait intéressant de regarder si les différentes combinaisons d’AcMs sont capables de détecter la protéine native (MxiH ou PrgI) sécrétée par la bactérie.

A l’aide du premier test réalisé in vivosur un petit nombre de souris et des analyses biochimiques pour les AcMs anti-IpaD/SipD, certains ont été sélectionnés afin d’être évalués en immunothérapie passive dans un modèle de salmonellose et de shigellose. Deux AcMs (IpaD-301 et IpaD-318) donnent une protection significative lorsqu’ils sont utilisés en prophylaxie c'est-à-dire 24 heures avant l’infection des souris soit par Salmonella (40% de protection) soit par Shigella (50% de protection). Ces AcMs protecteursin vivo ont été également testés en combinaison (IpaD-(301+318)) ce qui a confirmé leur efficacité thérapeutiquemais sans augmenter l'efficacité de protection par rapport aux AcMs administrés séparément. Cela s'explique par le fait que ces deux AcMs pourraient reconnaître le même épitope ou la même région de la protéine native.Certains AcMs testés dans le modèle d'infection par S. Typhimurium n'ont montré qu'une protection faible ou nulle avec un léger retard dans la mort des souris. Pour cette raison, ces derniers n’ont pas été utilisés dans la suite des tests in vivo.Pour S. flexneri, et par manque de temps, le premier test in vivo sur un petit nombre de souris n'a pas été réalisé et les AcMs ont été sélectionnés selon les résultats obtenus avec S. Typhimurium. L'idéal aurait été de refaire cette expérience avec Shigella afin de choisir les meilleurs AcMs neutralisants qui peuvent ne pas être les mêmes que ceux définis pourSalmonella.

A partir des premiers résultats obtenus in vivo, il a été décidé d’évaluer les AcMs protecteurs pour le traitement d'une infection à salmonelle ou shigelle. Les anticorps sélectionnés se révèlent moins efficaces lorsqu'ils sont administrés aux souris après l'infection. Dans le cas d’une infection avec 100 DL 50 de S. Typhimurium, seul le couple IpaD-(301+318) a pu montrer une légère protection de 30%, et seulement lors d'une administration très précoce, peu après l’infection. Injectés plus tardivement (un ou quatre jours après l’infection), cet effet protecteur disparait. Puisque

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Salmonellaest capable d'infecter les macrophages et s'y multiplier assez précocement, il paraît donc probable qu'elle échappe rapidement aux AcMs qui ne sont pas alors plus capables de stopper l'infection. La situation n’est pas très différente dans le cas d’une infection avecS. flexneri. A la différence des salmonelles, les shigelles ne se multiplient pas uniquement intracellulairement. Cependant, les AcMs ne se sont pas avérés plus efficaces en traitement contre l’infection. Cependant, la voie d'administration de Shigellafavorise sa dissémination rapide comme en témoignage l'apparition très précoce des symptômes après l'infection. Il est donc probable que les AcMs ne puissent pas neutraliser les bactéries suffisamment rapidement. Il serait intéressant de tester ces AcMs dans des conditions d'infection différentes, avec une dose plus faible de bactéries.

Dans le cadre d'une précédente thèse au laboratoire (Julie Prigent), des anticorps ont été développés contre la ricine, toxine produite par un arbuste, Ricinus communis, et qui est classée comme agent de la menace biologique de catégorie B(301). Cette étude a montré que des souris intoxiquées avec la ricine et protégées par des anticorps neutralisants sont ensuite protégées d'une deuxième intoxication à la ricine plusieurs mois après, après la disparition complète des anticorps circulants. C’est dans cette idée que nous avons souhaité effectuer les expériences d'immunothérapie « passive/vaccinante » avec les AcMs anti-IpaD/SipD qui ont donné des résultats surprenants et intéressants. Huit semaines après les administrations des AcMs, les anticorps IpaD-301 et IpaD-318 sont encore capables de les protéger contre une infection à Salmonella et Shigella sans une différence significative avec les taux de protection obtenus quand les souris sont traitées 24 h avant l'infection (Tableaux 25 et 26). Des expériences de pharmacocinétique sont en cours pour essayer de comprendre ces résultats.

Des expériences supplémentaires in vivo peuvent être envisagées pour compléter ce travail. Les AcMs anti-MxiH/PrgI qui ont été produits au laboratoire durant ma thèse n'ont pas pu être testés in vivo par manque de temps. Il serait intéressant de les tester in vivo, et dans l'hypothèse où certains pourraient présenter un effet protecteur, ils pourraient être combinés avec AcMs anti-IpaD/SipD ayant donné un effet neutralisant (IpaD-301 et IpaD-318). Il est en effet possible qu’une association de deux AcMs ciblant deux protéines différentes impliquées dans la virulence de Salmonella et Shigella puisse augmenter les effets des AcMs et favoriser l’opsonisation des bactéries.De plus, il serait important d'utiliser dans des modèles d'infection une autre espèce de Salmonella ou de Shigella afin de valider l'efficacité des AcMs dans la protection croisée au sein d'un même genre bactérien. Des tests in vitro pour valider l’effet neutralisant de nos AcMs, et en particulier leur capacité à bloquer l'entrée des bactéries dans des lignées cellulaires macrophagiques murines ou humaines seraient un outil intéressant de criblage des anticorps pour compléter ce travail.

Dans le contexte de l'approche thérapeutique par immunothérapie passive contre Salmonella, un nouvel anticorps appelé mAb-449 et dirigé contre le LPS de S. Typhimurium a été développé et

183 testéin vitro mais aussiin vivo(302). Les auteurs ont montré que cet AcM protège des souris BALB/c contre une infection avec 10 DL 50 par voie intrapéritonéale de S. Typhimurium quand il est injecté (à 200 µg ou 1 mg/souris) un jour avant l’infection et quatres semaines après deux immunisations avec du LPS par voie sous-cutanée (à 2.5 µg/souris). Dans cette même étude, il a également été montré que cet anticorps permet une augmentation de l’activation de macrophagesd’origine murine in vitro ainsi qu’une diminution du nombre de bactéries intracellulaires. En outre, de nouveaux AcMs dirigés contre des flagellines de Salmonella ont été développés dont certains présentent une efficacité relativement importante pour protéger contre les NTS Typhimurium et Enteritidis (303). Ces études montrent que l'immunothérapie passive est possible pour lutter contre une infection à salmonelle, bien que celle-ci soit un pathogène intracellulaire facultatif.

L'immunoglobuline dominante dans les muqueuses est l'IgA sécrétoire (sIgA) qui empêche la colonisation bactérienne et neutralise les pathogènes. Il pourrait donc êtreintéressant de produire et évaluer in vivo des AcMs de type IgA spécifiques des protéines du SST3 dirigés contre les protéines de l’aiguille et la coiffe de l’aiguille de Salmonella et Shigella dans le but de développer une protection mucosale qui pourrait être une alternative efficace pour protéger contre les infections impliquant les muqueuses (304,305). Une étude très récente a décrit également l’importance d’utiliser des AcMs produits contre les LPS les plus répandus des sérotypes de Shigellaflexneri (2a, 3a et 2b) et de S. sonnei, dans le développement d’un vaccin à large spectre composés de différents LPS de ces sérotypes (306). Toutes ces données tendent à montrer que les anticorps monoclonaux représentent une bonne alternative pour le traitement des infections à Salmonelles et à Shigelles et qu’une association de deux ou plusieurs AcMs, déjà caractérisés et dirigés contre différentes cibles de Salmonellaou de Shigella, pourraient limiter l’infection par ces bactéries, en particulier dans le contexte de l'augmentation des résistances aux antibiotiques. Il pourrait également être envisagé de coupler un traitement antibiotique à un traitement anticorps pour les souches résistantes aux antibiotiques, ce qui permettrait de potentialiser l’efficacité de l’antibiotique, et ainsi diminuer les concentrations utilisées et éviter la toxicité liée à la nécessité d’augmenter les doses pour rester efficaces.

Le laboratoire dans lequel j’ai effectué ma thèse possède une expertise dans le développement des tests de diagnostic rapides immunochromatographiques (dits tests bandelettes) et a déjà développé des anticorps spécifiques de différentes espèces de shigelles et salmonelles, dont les cibles sont différentes des protéines du SST3. Les AcMs dirigés contre MxiH/PrgI et IpaD/SipD obtenus dans le cadre de mon doctorat, pourraient compléter les tests déjà développés pour la détection de ces protéines de l’injectisome de Salmonella et Shigella dans différents échantillons biologiques : dans le sang, dans les lavages broncho-alvéolaires et autres. Bien que non spécifiques du genre bactérien (car par définition reconnaissant à la fois shigelle et salmonelle), ils pourraient permettre d'augmenter la sensibilité des tests déjà existants. Dans le cadre d'une précédente thèse au laboratoire (Jérôme

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Laporte), des anticorps ont été développés contre LcrV, protéine de la coiffe du SST3 de Yersiniaet les résultats obtenus pour leur utilisation en diagnostic rapide bandelettes sont prometteurs(307), ce qui laisse bon espoir pour l'utilisation en diagnostic rapide des anticorps développés au cours de mon doctorat.

Ce travail ne s'arrêtra pas à la fin de ma thèse car les anticorps développés et capables de protéger contre des infections à salmonelles/shigelles seront exploités pour un autre projet de thèse, en collaboration avec Dr. Bernard Maillère.

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CONCLUSION GÉNÉRALE

Les vaccinations représentent un des progrès le plus évident et le plus constant dans la lutte contre les maladies infectieuses. Depuis sa découverte à la fin du XVIIIème siècle, la vaccination voit son développement s'accélérer depuis plus de 60 ans. Le futur de la vaccination s'annonce riche en découvertes avec la recherche pour le développement de vaccins contre certains cancers, la maladie d'Alzheimer ou le VIH. L'immunothérapie passive se révèle aussi être une piste intéressante pour de nombreuses maladies infectieuses pour lesquelles il n'existe pas ou plus de traitements disponibles (il existe déjà des anticorps pour le traitement de certaines maladies infectieuses, comme par exemple le virus rétrosyncitial).

Dans le cadre de ma thèse, nous nous sommes intéressés dans un premier temps à évaluer l'immunogénicité de deux protéines du Système de Sécrétion de Type III (SST3) et leur rôle de protection contre les bactéries pathogènes Salmonella etShigella. Après avoir produit chacune des protéines recombinantes composant l'aiguille et la coiffe de l'aiguille de cet injectisome de Salmonella (PrgI et SipD) et Shigella (MxiH et IpaD), il est apparu que ces dernières induisent des réponses humorales importantes. Cette réponse varie selon la voie d'immunisation utilisée : sous-cutanée, intra-nasale et intra-gastrique. L'efficacité de protection de ces protéines contre une infection avec 100 DL 50 de S. Typhimurium et S. flexneri 2a a été validée dans des modèles murins in vivo avec un taux de protection compris entre 40 et 70% pour les voies intra-nasale et intra-gastrique capables d'induire des réponses locales mucosales. Une partie de ces résultats obtenus fait l'objet d'une publication scientifique en cours de révision dans " PLOS neglected tropical diseases".

Ces protéines recombinantes relativement bien conservées parmi les bactéries entéropathogènes sont de bons candidats pour assurer une protection croisée contre les bactéries utilisant le SST3 dans leurs mécanismes d'infection. En effet, les protéines de la coiffe de l'aiguille SipD et IpaD permettent d'induire des réponses croisées, contre les régions conservées des protéines. Les résultats obtenus montrent une protection croisée Salmonella-Shigella qui sont encourageants et qui n'ont à notre connaissance jamais été décrits, et qui valident l'approche utilisée.

Un autre aspect de mon travail de thèse a consisté à produire des anticorps monoclonaux murins contre les régions conservées des protéines de la coiffe de l'aiguille de l'injectisome qui est un facteur de virulence clé de nombreuses bactéries entéropathogènes. Les panels d'anticorps monoclonaux obtenus contre SipD et IpaD permettent la reconnaissance de celles-ci sous leurs formes recombinantes. En outre, bien que non total, un effet neutralisant de ces anticorps a été observé dans un modèle in vivo d'infection gastrique avec S. Typhimurium et d'infection pulmonaire avec S.

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flexneri2a chez la souris. Des expériences supplémentaires sont en cours afin de confirmer et améliorer ces résultats. Ces anticorps pourraient également être utilisés pour des tests de diagnostic contre Salmonella et Shigella. A notre connaissance, ces travaux sont les premiers rapportant l'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre le SST3 pour l'immunothérapie passive de ces bactéries entéropathogènes, et il pourrait être envisagé, pour le cas particulier des souches antibiorésistantes, de combiner ces anticorps à une antibiothérapie, ce qui permettrait de diminuer les doses d'antibiotiques nécessaires aux traitements, et les utiliser à des doses non toxiques.

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RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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