Discussion

Dans ce travail nous avons pu étudier le système GloSensor comme outil de mesure en cinétique de l’AMPc intracellulaire et confirmer que la sensibilité de cet outil permet de mesurer l’inhibition des AC par la protéine Gi/o suite à l’activation de NPFF1R par le RFRP3. Nous avons montré que l’inhibition des phosphodiestérases par l’IBMX augmente de manière dose-dépendant le signal AMPc basal et potentialise les réponses AMPc de la forskoline et de l’isoprotérénol. Alors que décrit comme inhibiteur compétitif des PDE (Beavo, 1995), nous avons pu observer que l’IBMX, à forte concentration (1 mM), ralentit la formation d’AMPc. Nous avons également pu montrer que la forskoline et l’IBMX utilisés conjointement diminuent la sensibilité de mesure de la réponse Gi/o du NPFF1R, ce qui n’est pas le cas s’ils sont utilisés séparément.

4.1. Saturation du signal AMPc mesuré

Dans les cellules HEK-Glo utilisées, la forskoline active la production d’AMPc avec une EC50

d’environ 5 µM, en accord avec les valeurs de 5- 10 µM décrites dans la littérature (DiRaddo et al., 2014; Seamon and Daly, 1981). L’inhibition des PDE par l’IBMX empêche la dégradation de l’AMPc, ce qui augmente le signal induit par la forskoline. Cette amplification du signal se traduit par un déplacement vers la gauche de la courbe effet-dose de la forskoline, sans modifier son amplitude de réponse. A la différence de la forskoline, la présence d’IBMX déplace vers la gauche la courbe effet-dose de l’isoprotérénol en augmentant son amplitude de réponse de manière dose-dépendante, jusqu’à un maximum d’amplification obtenu pour la concentration de 0,3 mM d’IBMX. L’IBMX est un inhibiteur des phosphodiestérases, et entre en compétition avec l’AMPc pour se lier sur le site actif de ces PDE, ce qui explique que l’IBMX augmente de manière dose dépendante l’amplitude de la réponse de l’isoprotérénol (Hill et al., 2010). L’absence d’effet sur l’amplitude de réponse de la forskoline peut s’expliquer par un « effet plafond», la forskoline sans IBMX ayant une amplitude de signal similaire à celle de l’isoprotérénol avec 0,3 mM d’IBMX. La stimulation par la forskoline de l’adénylate cyclase conduit à des niveaux d’AMPc intracellulaires si élevés que les concentrations d’IBMX

utilisées pourraient ne pas être suffisantes pour entrer en compétition avec l’AMPc sur le site actif des PDE. Il est également envisageable que ces niveaux d’AMPc activent des voies de dégradation qui ne sont pas inhibées par l’IBMX, bien qu’il n’y ai pas d’éléments qui aillent dans ce sens dans la littérature. Enfin, cet effet plafond pourrait également résulter de la saturation du système GloSensor de mesure de l’AMPc, cet outil étant décrit comme sensible à des concentrations d’AMPc comprises entre 10 nM et 1 µM (Proméga).

4.2. Effet délétère de l’IBMX à 1 mM

L’IBMX potentialise les réponses AMPc de la forskoline et de l’isoprotérénol de manière dose-dépendante jusqu’à 0,3 mM d’IBMX. Les effets délétères observés à 1 mM, avec un ralentissement de la production d’AMPc ainsi qu’une moins bonne réponse de l’isoprotérénol, ne sont pas étayés dans la littérature, ce qui peut en partie s’expliquer par la découverte relativement récente (environ 10 ans) de ces systèmes dynamiques de mesure de la cinétique de l’AMPc (Hill et al., 2010). Bien que cette observation soit intéressante dans la mesure où l’IBMX est souvent utilisé à forte concentration (Multispan) pour évaluer l’activité de RCPG, il serait pertinent de reproduire cette étude avec d’autres types cellulaires, ou avec d’autres systèmes de détection de l’AMPc (Hill et al., 2010). Il a déjà été rapporté que dans les cellules SHSY-5Y, l’IBMX ne permet pas d’augmenter le signal AMPc alors que d’autres inhibiteurs de phosphodiestérases comme le rolipram, inhibiteur de la PDE4, sont actifs (Morgan et al., 1993). L’hypothèse avancée dans cette étude porte sur l’activité antagoniste de l’IBMX vis-à-vis des récepteurs à l’adénosine. En effet, l’IBMX possède une affinité pour les récepteurs à l’adénosine évaluée aux environs de 1 à 10 µM (Nicholson et al., 1989) et pourrait bloquer l’action autocrine de l’adénosine (Morgan et al., 1993). De plus, dans la mesure où l’IBMX a une capacité à inhiber les PDE quantifiée par son IC50 aux environs de 2 à 50 µM (Beavo, 1995; Weston et al., 1997), il ne semble pas justifié d’utiliser des concentrations d’IBMX aussi élevées que 1 mM.

4.3. Relation entre IBMX, forskoline et mesure de l’activation de NPFF

R par

le RFRP3

La forskoline, utilisée pour activer les adénylate cyclases, permet de révéler l’activité inhibitrice de la protéine Gi/o sur ces dernières. De fait, en augmentant la concentration de forskoline, les AC devraient être plus fortement stimulées et donc plus difficilement inhibées. Cela correspond à une diminution de la sensibilité de la mesure de l’activité Gi/o, comme observée pour des concentrations de forskoline allant de 0,5 µM à 5 µM dans la réponse de l’histamine sur son

récepteur mH4R (Nordemann et al., 2013). Cependant, dans notre cas, pour des concentrations de 0,5 – 1 – 5 M de forskoline, la réponse de NPFF1R au RFRP3 n’est pas modifiée (Figure 16A). Dans l’étude de Nordemann et collaborateurs, la puissance de la forskoline (EC50) dans les cellules exprimant mH4R est d’environ 1 M, les concentrations utilisées de forskoline sont donc supérieures ou égales à son EC50, alors que dans notre situation, la forskoline a été utilisée à une concentration inférieure à son EC50 (qui est d’environ 5 M). Cette différence est une explication possible à l’absence d’effets modulateurs des différentes concentrations de forskoline testées sur la réponse de NPFF1R au RFRP3. Cependant, comme le signal AMPc sature à partir de 10 M de forskoline, il n’a pas été possible d’utiliser des concentrations de forskoline supérieures à son EC50.

Lorsque la dégradation de l’AMPc est inhibée par 0,1 mM d’IBMX, la forskoline utilisée à 0,3 µM et 0,6 µM diminue la sensibilité de détection de l’activité de NPFF1R par RFRP3 (Figure 16C). Or l’EC50 de la forskoline passe de 5 M en absence d’IBMX à 0,25 M en présence d’une concentration de 0,1 mM d’IBMX. Dans ce cas de figure, les concentrations de 0,3 M et 0,6 M de forskoline sont donc supérieures ou égales à son EC50, ce qui permet de retrouver une interaction des concentrations de forskoline sur la réponse Gi/o en accord avec l’étude faite sur le récepteur mH4R (Nordemann et al., 2013).

Cette analyse suggère que l’IBMX n’impacte pas directement la réponse de NPFF1R au RFRP3 mais peut interférer sur cette mesure en potentialisant la production d’AMPc induite par la forskoline. Pour tester cette hypothèse nous avons réalisé une expérience complémentaire en ajustant la concentration de forskoline utilisée pour chaque concentration d’IBMX de sorte que la réponse de NPFF1R au RFRP3 soit mesurée à des niveaux d’AMPc similaires quelque soit les conditions de forskoline et d’IBMX testées (Figure 19). Pour utiliser des concentrations équipotentes de forskoline, nous avons ajusté sa concentration à son EC50 mesurée pour chaque concentration d’IBMX (Figure 15A et Tableau 5), soit une concentration en forskoline de 4 – 1,5 – 0,7 – 0,25 – 0,15 – 0,12 M respectivement pour des concentrations en IBMX de 0 – 0,01 – 0,03 – 0,1 – 0,3 et 1 mM. Dans ces conditions, les niveaux d’AMPc intracellulaires sont équivalents (Figure 19B), et le NPFF1R présente une réponse au RFRP3 de même amplitude et avec une EC50 similaire quelque soit la concentration en IBMX (Figure 19A). Ce résultat montre que l’IBMX n’a pas d’effet direct sur la sensibilité de mesure de l’activité Gi/o et que l’effet observé de l’IBMX sur l’activité Gi/o (Figure 18E) est dépendant de la forskoline. La

perte de sensibilité provoquée par l’IBMX pour une concentration constante de forskoline (Figure 17E) correspond donc en fait à une potentialisation des effets délétères de la forskoline.

4.4. Conclusion

Cette étude a permis de comprendre la relation entre l’IBMX, la forskoline et la réponse Gi/o mesurée avec le système GloSensor. Pour l’étude des récepteurs couplés Gi/o de la famille des peptides RF-amide qui suit, nous avons choisi des conditions de forskoline et d’IBMX nous permettant d’observer un signal AMPc robuste et reproductible mais suffisamment éloigné du niveau de saturation afin de pouvoir détecter une éventuelle stimulation des AC par la voie Gs. Nous avons choisi de travailler en présence de 0,1 mM d’IBMX et 0,4 µM de forskoline, soit un peu plus que l’EC50 de la forskoline afin que l’amplitude de réponse soit légèrement sub-optimale (Figure 18A), ce qui devrait nous permettre de détecter une éventuelle augmentation de l’amplitude de réponse.

III. Caractérisation de récepteurs fluorescents exprimés