III. Caractérisation de récepteurs fluorescents exprimés seuls ou par paire
5. Discussion – conclusion
Devant les problèmes de localisation cellulaire rencontrés avec les récepteurs fusionnés avec la mCherry et l’incohérence des résultats trouvés avec cette nouvelle lignée CFP-hGPR103 / YFP-hNPFF1R par rapport aux lignées mCherry-hGPR103 / EGFP-hNPFF1R, nous avons décidé de ne pas poursuivre cette étude.
5.1. La biologie moléculaire
Les travaux de biologie moléculaire ont permis de générer une banque de plasmides codant pour chaque récepteur RF-amide avec une étiquette CFP, YFP, EGFP, mCherry ou Flag fusionnée en N-terminale. La séquence codante pour le récepteur NPFF2R a été visiblement mal tolérée par le type de bactérie utilisée lors de ces clonages (E.coli « Stellar »), avec un fort taux de mutation et de réarrangement de cette séquence. De plus, les clones contenant le plasmide avec cette séquence intacte montrent une vitesse de pousse réduite, et la purification
du plasmide après amplification montre des rendements inférieurs de 10 à 100 fois comparés aux autres récepteurs.
Le passage d’un clonage par technique LIC (sans ligation) à un clonage classique par enzyme de restriction a permis de réduire un peu les phénomènes de recombinaisons de la séquence codante pour NPFF2R. Cette solution, bien que moins élaborée, conserve une plus grande flexibilité. Grâce à l’amélioration des vitesses de digestion et de ligation ce type de clonage devient aussi, voire plus rapide qu’un clonage LIC.
Dans le but d’améliorer les rendements de production de plasmides et de trouver une souche bactérienne qui tolère mieux cette séquence, un criblage de différentes bactéries aurait pu être réalisé. Ce criblage n’a pas été réalisé dans la mesure où nous avons principalement travaillé en pharmacologie avec des lignées stables, nous n’avons pas eu besoin de grandes quantités de plasmides.
5.2. Expression et co-expression des récepteurs RF-amide
Pour étudier la pharmacologie in vitro des récepteurs RF-amide et la possibilité d’interactions fonctionnelles, nous avons choisi de travailler en cellules de mammifère en expression transitoire. Un travail de mise au point des conditions de transfection n’a pas donné de résultats satisfaisants en cellules CHO avec moins de 5% de cellules co-transfectées, mais a permis d’identifier avec les cellules HEK des conditions permettant d’obtenir environ 10% de cellules co-transfectées avec 2 récepteurs RF-amide. Ce niveau de transfection est tout juste suffisant pour observer une réponse fonctionnelle de ces récepteurs mais nous avons jugé que ces conditions n’étaient pas suffisantes pour une étude détaillée de la pharmacologie de ces récepteurs. Pour cette raison, nous avons généré des lignées stables exprimant seuls ou par paires les récepteurs RF-amide, en se concentrant sur l’interaction entre GPR103 et NPFF1R.
5.3. Interactions entre GPR103 et NPFF
1R
L’étude des réponses AMPc et calcique des récepteurs mCherry-GPR103 et EGFP-NPFF1R a permis d’identifier un comportement de ces récepteurs différent selon qu’ils soient exprimés seuls ou ensemble. Le peptide 26RFa, qui a une forte affinité pour GPR103 et une faible affinité pour NPFF1R (Quillet et al., 2016), provoque une réponse AMPc biphasique en cas de co-expression de deux récepteurs, avec une composante Gs avec laquelle vient entrer en compétition une composante Gi/o. Avec la réponse calcique de GPR103, le 26RFa induit donc à la fois l’activation des protéines Gs, Gi/o et Gq lorsque les récepteurs GPR103 et NPFF1R sont
co-exprimés. Il est possible que l’hétérodimérisation de deux récepteurs leur permettent d’induire une nouvelle signalisation : par exemple l’activation simultanée des récepteurs à la dopamine D1R (Gs) et D2R (Gi/o) permet le recrutement de Gq et une réponse calcique (Lee et al., 2004; Rashid et al., 2007), et l’activation simultanée des récepteurs 2CAR (Gi/o) et AT1R (Gq) exprimés dans la même cellule permet une signalisation par la voie Gs – AMPc – PKA (Bellot et al., 2015). Il serait donc possible que le 26RFa se lie conjointement aux récepteurs GPR103 et NPFF1R pour une nouvelle signalisation par la protéine Gs. Il serait intéressant de mesurer d’autres intermédiaires cette cascade de signalisation comme la protéine G elle-même ou des protéines kinases pour mieux comprendre pourquoi et comment les protéines Gi/o et Gs
sont activées simultanément, et de bloquer sélectivement chaque récepteur à l’aide d’antagonistes, de manière similaire à l’expérience réalisée en réponse calcique (Figure 30H). En présence de GPR103, la réponse de NPFF1R au RFRP3 est fortement diminuée, voire abolie. Ce phénomène est retrouvé dans plusieurs lignées stables et n’est pas observé avec NPFF2R et GPR103, ce qui suggère que cette perte de réponse de NPFF1R n’est pas artefactuelle. En cas de co-expression GPR103 et NPFF1R, le RFRP3 ne semble pas modifier la production d’AMPc ni le calcium intracellulaire ce qui suggère que les protéines Gs et Gq ne sont pas activées. Il serait donc intéressant de comparer l’affinité de RFRP3 pour NPFF1R en présence de GPR103 pour vérifier si l’affinité de NPFF1R est modifiée par GPR103. En effet il est possible que l’interaction entre deux récepteurs conduisent à une diminution, voire une perte d’affinité de l’un des deux récepteurs pour son ligand (Birdsall, 2010) : ainsi la présence de GPR50 suffit à inhiber la liaison de la mélatonine à son récepteur MT1R lorsque ces deux récepteurs sont co-exprimés dans les mêmes cellules (Levoye et al., 2006).
De manière surprenante, cette perte de sensibilité au RFRP3 n’est pas reproduite quand les récepteurs sont marqués avec les étiquettes CFP et YFP. Le biais induit par la mCherry en N-terminal de GPR103 ne suffit pas à expliquer cette différence, dans la mesure ou la présence de mCherry-hGPR103 ne modifie pas le fonctionnement de EGFP-hNPFF2R. Il est possible que les niveaux d’expression soient différents entre les lignées EGFP/mCherry et CFP/YFP, mais il n’est pas possible de comparer directement les mesures de fluorescence faites par cytométrie en flux entre fluorophores différents. Par contre, il serait possible de mesurer et de comparer les niveaux d’expression entre mCherry-hGPR103 / EGFP-hNPFF1R et CFP-hGPR103 / YFP-hNPFF1R en utilisant des billes de calibration de fluorescence. Ces billes possèdent un nombre connu d’un fluorophore donné à leur surface et permettent d’établir une relation entre un niveau
de fluorescence mesuré sur un appareil donné avec un nombre de fluorophore. En analysant par cytométrie en flux la fluorescence des cellules et en la comparant aux billes de calibration, il est donc possible de convertir la fluorescence des cellules en une unité de nombre d’équivalent de fluorophores (MESF, Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome) (Gerena-López et al., 2004).
La localisation atypique du récepteur mCherry-hGPR103 ainsi que l’absence de cohérence des résultats obtenus avec les récepteurs CFP-hGPR103 et mCherry-hGPR103 nous ont amené à arrêter le développement de ce projet.