Discussion

L’utilisation de modèles 3D passe tout d’abord par une bonne qualité de l’ensemencement, c’est-à-dire une répartition homogène des cellules au sein des canaux et une bonne reproductibilité. Sans cela, il est extrêmement compliqué d’interpréter les résultats obtenus à la fois au sein d’une même expérience mais aussi entre plusieurs expériences distinctes. Bien que les ensemencements dynamiques soient souvent décrits comme améliorant le nombre de cellules ensemencées, il convient tout de même de noter que, dans notre cas, la rotation seule ne permet pas une bonne reproductibilité de l’ensemencement bien que les densités observées soient plus élevées (Du et al., 2009; Kim et al., 1998; Wendt et al., 2003). Cela peut être expliqué par l’architecture de notre biomatériau, des canaux de plusieurs millimètres sans interconnexion où l’air aurait des difficultés à être expulsé. C’est pourquoi combiner rotation et vides multiples permet un passage de la suspension cellulaire dans chaque pore, assurance d’une bonne reproductibilité. Malheureusement, les sensités d’ensemencement obtenues restaient très inférieures à la rotation seule, et le rendement de cette approche demandera à être amélioré. Après l’ensemencement, les biomatériaux sont placés au sein du bioréacteur BOSE et cultivés sous perfusion, en milieu ostéogénique. La perfusion permet d’assurer l’apport des nutriments aux cellules sur toute la longueur du pore, mais également génère un stimulus mécanique sous forme de forces de cisaillement. Ces forces de cisaillement pourraient être utilisées pour moduler le comportement des cellules in

vitro, comme par exemple en stimulant l’ostéogénèse (Bancroft et al., 2002; Barron et al., 2012; McCoy et al., 2012a). Après 7 jours de culture dans le BOSE, un flux de perfusion de 50 µL.min-1 (10 µm.s-1) a considérablement stimulé la croissance des cellules, au point que la perfusion n’étaiit plus assurée sur toute la longueur des canaux (cellules mortes en sortie). A l’inverse, un flux dix fois plus important, de 500 µL.min-1

(100 µm.s-1), a permis une bonne perfusion sur l’ensemble des pores mais limitait la croissance des cellules. Le flux de perfusion de 300 µL.min-1 (60 µm.s-1) assure un bon compromis, c’est-à-dire une bonne croissance cellulaire homogène sur le long des pores qui se maintient pendant toute la durée de la culture. Il convient donc d’adapter le débit au système utilisé, comprenant la combinaison d’un bioréacteur et d’un matériau particulier. Ces raisons expliquent la discordance existant entre les

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différentes études sur la différenciation ostéoblastique sous perfusion, rendant leur comparaison difficile (Bouet et al., 2015c; Cartmell et al., 2003).

Tout comme dans nos études préliminaires présentées ci-dessus et réalisées sur les substrats macroarchitecturés en boite de culture, la croissance des cellules de calvaria sous perfusion dans le bioréacteur est apparue stimulée par les angles de 45° (mimant le motif « T ») et moins active dans les angles de 90° (« T2 »). Cependant, contrairement à ce que l’on pouvait attendre, la croissance des cellules primaires de calvaria dans les biomatériaux HA était très limitée dans les pores circulaires alors que les mises au point avaient montré qu’après 7 jours de culture les cellules avaient formé une couche tissulaire conséquente. De plus, la coloration au Rouge d’Alizarine a permis d’observer la présence d’une MEC minéralisée importante dans les pores centraux des matériaux en PMMA. Cette différente est sans doute due aux types cellulaires utilisés (C3H10T1/2 pour les mises au point vs cellules primaires de calvaria pour les cultures ostéogéniques), aux compositions de matériaux différents (PMMA vs HA) mais aussi aux textures/microtopographies (surface non polie en PMMA, résolution d’impression des biomatériaux HA). Nous avons tout de même réussi à mettre en évidence la présence de matrice minéralisée déposée par les cellules de calvaria dans un matériau en PMMA, et par conséquent le fait que les progéniteurs sont capables de se différencier en ostéoblastes matures dans nos conditions de culture. De plus, le dosage ELISA a montré la sécrétion de quantités importantes d’OPN par les cultures en biomatériaux HA. L’augmentation des quantités dosées avec le temps de culture reflète certainement l’accumulation d’OPN dans le milieu (le circuit de perfusion est fermé) ; celle-ci est sans doute aussi compensée par la dégradation de la protéine en fragments non dosables (Bouet et al., 2015b). La contribution de ces mécanismes opposés aux valeurs finales dosées n’a pas été évaluée. Le plateau de la courbe entre J14 et J18 pourrait correspondre à la diminution d’OPN observée sur les cultures cellulaires en boite de Pétri entre J6 et J15 (voir Etude

1), diminution qui pourrait être compensée par l’accumulation d’OPN neuve dans le

milieu. Il est intéressant de noter que, bien que l’ensemencement des biomatériaux ait été réalisé avec la technique de rotation seule (la moins reproductible), l’écart des valeurs entre les matériaux de géométries différentes s’est maintenu sur la durée de la culture, et la variabilité inter-matériau (voir les écarts-types) est demeurée raisonnable.

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Bien que le dosage ELISA ait indiqué une augmentation de l’OPN sécrétée dans les biomatériaux, la qualification du stade de différenciation des ostéoblastes s’est révélée être difficile. En effet, en raison de la forte affinité des ARN messagers pour l’hydroxyapatite, il n’a pas été possible de recueillir suffisamment de matériels pour réaliser des analyses qRT-PCR. De même, des dosages ELISA pour des marqueurs ostéoblastiques matures (ostéocalcine, sclérostine) ne se sont pas révélés concluants du fait de la trop grande dilution de ces protéines dans le milieu de culture circulant et/ou une dégradation trop rapide.

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