Diagnostic chez l'hôte intermédiaire de la sarcosporidiose aiguë de son

4.2.1. Diagnostic clinique

Il est très difficile, aussi bien dans la forme aiguë que dans la forme chronique de l’infection, qui ne comporte pas toujours de symptômes et dont les symptômes, lorsqu’ils se manifestent sont très frustes et non spécifiques. Du point de vue clinique, on ne peut avoir que des éléments de suspicion (Euzéby 1998).

4.2.2. Diagnostic de laboratoire

4.2.2.1. Examens biochimiques

On peut réaliser un dosage du taux sérique de la lactate-déshydrogénase et de la sorbitol-déshydrogénase. Ces examens ne font qu’étayer l’hypothèse clinique et ne confirment en aucun cas le diagnostic (Euzéby 1998).

4.2.2.2. Examens hématologiques

On peut rechercher les mérozoïtes, libres ou inclus dans les monocytes. Cette recherche n’est concluante qu’en cas de positivité. De plus, la formule leucocytaire met en évidence une lymphocytose qui n’est en aucun cas pathognomonique de la sarcosporidiose (Euzéby 1998).

4.2.2.3. Examens sérologiques

Les méthodes immunologiques permettent de détecter l'infestation mais ne permettent pas de différencier les espèces de sarcosporidies impliquées. En effet, il existe de nombreuses réactions croisées entre les différentes espèces mais également avec T. gondii (3 à 4% des cas) (Tenter, 1995 ; Euzéby 1998). Ces tests

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sont réalisables du vivant de l'animal à partir du sérum. Ils peuvent être mis en œuvre avec des échantillons individuels ou avec un mélange de sérums.

Les méthodes immunologiques ne permettent pas de détecter la sarcosporidiose dans sa phase aiguë ou après un avortement induit par la sarcosporidiose car les niveaux d'anticorps sont trop faibles (Tenter, 1995). La réponse IgM est transitoire, elle apparaît à 20 jours et ne persiste que quatre mois. La réponse IgG apparaît 30 jours après l'infestation, atteint son pic au bout de 3 mois et dure 2 ans voire davantage (Uggla, Buxton, 1990 ; Euzéby 1998).

4.2.2.3.1. L'IHAT (Indirect Haemagglutination Antibody Test)

L'hémagglutination indirecte (Lunde, Fayer, 1977) est réalisée avec des érythrocytes de mouton "sensibilisés", c'est-à-dire ayant été mis en contact auparavant avec des antigènes de Sarcocystis spp., et du sérum de bovin dans des puits de plaques de micro-titration.

Le test utilise des antigènes issus des bradyzoïtes et des mérozoïtes. Ils sont libérés des kystes par une technique de digestion utilisant une solution à base de pepsine et de HCl à 37°C sous agitation magnétique. Puis, la solution de mérozoïtes et de bradyzoïtes est centrifugée à 10000 G pendant 30 min. Le surnageant est récupéré et forme la solution d'antigène. La solution d'antigène est mise au contact du sérum de bovin à tester. Le test est lu après une incubation de 1h à 37°C. Les érythrocytes de mouton non "sensibilisés" sont utilisés comme témoins de contrôle négatif (Lunde, Fayer 1977).

4.2.2.3.2. L'AGID (Agar Gel ImmunoDiffusion)

L'immunodiffusion sur gel (Lunde, Fayer, 1977) se réalise dans une gélose percée de puits. Une solution d'antigènes non-dilués est placée dans un puits central, du sérum non-dilué est placé dans les puits en périphérie. La solution d'antigène est issue du surnageant d'une solution de mérozoïtes et de bradyzoïtes centrifugés à 10000 G pendant 30 min. Le test est lu après incubation à 4°C pendant 3 à 4 jours.

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Ce test est moins sensible que l'hémagglutination indirecte (Lunde, Fayer, 1977).

4.2.2.3.3. L'IFAT (Indirect Fluorescent Antibody Test)

Le test par immunofluorescence indirecte (Moré et al., 2007; Moré et al., 2010; Moré et al., 2011) est réalisé avec du sérum, des anticorps IgG anti-bovin conjugués avec de l'isothiocyanate de fluorescéine associés à des techniques de fixation et à la microscopie à fluorescence.

Le test utilise des antigènes issus des bradyzoïtes contenus dans les kystes. Les bradyzoïtes sont récupérés après digestion avec de la pepsine et de l’acide chlorhydrique. Deux techniques sont possibles. Soit, ils sont homogénéisés avec un homogénéiseur de tissu et soumis à une sonication, puis les antigènes sont récupérés et adsorbés sur des disques de cellulose ; soit, les bradyzoïtes sont fixés directement dans des puits sur des lames (Moré et al., 2007). La fluorescence est mesurée à 540 nm sous une lumière de 475 nm avec un fluoromètre (Ely, Fox 1989). Du sérum de fœtus de bovin est utilisé comme témoin de contrôle négatif (Moré et al., 2007).

Il n'y a pas de réaction croisée avec T. gondii avec la technique d'IFAT (Moré et al., 2007). Cette technique est la plus utilisée (Ely, Fox 1989; Latif et al., 1999; Moré et al., 2007; Moré et al., 2010; Moré et al., 2011).

4.2.2.3.4. L'ELISA (Enzyme-Linked

ImmunoSorbent Assay)

La méthode immuno-enzymatique ELISA est réalisée avec du sérum, des anticorps IgG anti-bovin (Metwally, Abd Ellah, AL-Hosary, Omar, 2013) ou anti-caprin (Kalubowila, Udagama-Randeniya, Perera, Rajapakse, 2004) conjugués à une peroxydase et un substrat à base de TMB ou tétraméthylbenzidine.

Les antigènes utilisés pour ce test proviennent de mérozoïtes ou de bradyzoïtes. Une solution de mérozoïtes ou de bradyzoïtes est centrifugée à 15000 G pendant 30 min, le surnageant est récupéré et forme la solution d'antigènes

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(Kalubowila, Udagama-Randeniya, Perera, Rajapakse, 2004). Cette solution d'antigène, diluée dans un tampon, est utilisée pour recouvrir la surface des puits d'une plaque de micro-titration. Les plaques sont incubées une nuit à 4°C. Puis, chaque puits est rempli avec du sérum de lapin et un tampon et la plaque est incubée 1h30 à 37°C. Après lavage de la plaque, on ajoute le sérum à tester et on incube 1h30 à 37°C. Ensuite, on lave de nouveau la plaque et on ajoute les anticorps anti-bovin ou anti- caprin et on incube 1h30 à 37°C. Enfin, après un dernier lavage de la plaque, on ajoute le tétraméthylbenzidine et le test est lu après 10 min. La densité optique est mesurée à 405 nm (Savini, Robertson, Dunsmore, 1997a; Kalubowila, Udagama-Randeniya, Perera, Rajapakse, 2004) ou 450 nm (Metwally, Abd Ellah, AL-Hosary, Omar, 2013). Du sérum de fœtus de bovin peut être utilisé comme témoin de contrôle négatif additionnel (Kalubowila et al. 2004).

Les antigènes issus des bradyzoïtes sont plus adaptés à la détection des formes chroniques de l'infestation. Les antigènes issus des mérozoïtes sont plus adaptés à la détection des phases aiguës de l'infestation (Kalubowila et al. 2004). La spécificité et la sensibilité sont supérieures lorsqu'on utilise les antigènes de mérozoïtes : respectivement 97% et 98 % (contre 84% et 95% avec des antigènes de bradyzoïtes). En effet, avec les mérozoïtes comme base des antigènes, l'ELISA détecte des titres en anticorps plus élevés et plus précocement (Savini, Robertson, Dunsmore, 1997b). Les IgM ne peuvent pas être utilisées car le pic d'IgM dure peu de temps (Savini, Robertson, Dunsmore, 1997a).