Diagnostic bactériologique

En complément de l’anamnèse et du statut clinique, l’examen du liquide synovial est la pierre angulaire du diagnostic d’arthrite.

Le liquide articulaire a pour fonction de lubrifier les articulations et transférer les éléments nutritifs au cartilage articulaire.

Son examen permet de distinguer les liquides inflammatoires, mécaniques, infectieux et hémorragiques.

Il est impératif de rappeler que le traitement antibiotique, sauf en cas de sepsis, ne doit pas être débuté avant la réalisation des prélèvements à visée microbiologique.[44]

Des cultures faussement négatives dues à plusieurs facteurs à savoir : ‐ Une antibiothérapie préalable;

‐ Des bactéries de croissance fastidieuse ou structurées en biofilm; ‐ Des micro-organismes ne se cultivant pas sur les milieux usuels;

‐ La mort des bactéries à cause de mauvaises conditions de transport ou de l'antibiothérapie locale libérée lors du retrait de l’implant.

Le recours à d'autres techniques comme la biologie moléculaire dans ces cas reste nécessaire et justifié. [45]

 Prélèvements :

Après désinfection soignée de la peau, on recueille le liquide dans une seringue, puis on le transfert dans au moins 2 tubes :

‐ Un tube EDTA pour la cytologie.

‐ Un tube sec ou pot stérile pour la bactériologie, l’examen des cristaux et les dosages.

La sensibilité et la spécificité de la culture des prélèvements sont respectivement de 80 et 93% selon la définition d'une IOA (infection ostéo-articulaire)[45]

Ces prélèvements doivent parvenir immédiatement au laboratoire de microbiologie (maximum 24H),où ils seront pris en charge de manière spécifique selon les protocoles en vigueur. [44]

 Transport et stockage des prélèvements :

Les prélèvements doivent être remis au laboratoire dans des récipients stériles, adaptés (seringue sans aiguille et closes ou tubes secs stériles ou flacons stériles) et acheminés rapidement au laboratoire (< 2 heures à température ambiante).

En cas d'impossibilité, la mise en place de milieux de transport pour la recherche de germes exigeants est fortement recommandée.

Pour les liquides articulaires, il est fortement recommandé d'injecter le liquide dans un tube contenant de l'héparine pour la numération des éléments.

En cas de réalisation d'un examen de biologie moléculaire, l'utilisation de tube EDTA est préconisée.

En parallèle de ces conditionnements, il est possible d'ensemencer des flacons d'hémocultures avec les liquides de ponction.

Pour les prélèvements tissulaires, des flacons stériles secs ou avec milieux de transport peuvent être utilisés.

Les prélèvements doivent être accompagnés d'une fiche de renseignements comportant au minimum les renseignements suivants : localisation précise de la ponction, existence d'une antibiothérapie, antécédents concernant le site d'infection, etc.

Ces informations sont indispensables pour l'interprétation des résultats et l'instauration de recherches spécifiques.

En parallèle des prélèvements de la localisation potentiellement infectée, la réalisation de prélèvements annexes peut conforter le diagnostic et/ou déterminer la porte d'entrée de l'infection : hémocultures, ECBU, prélèvement de gorge, de plaie ou génital, etc.

 Traitement de l'échantillon :

Au laboratoire, les prélèvements doivent être systématiquement manipulés avec précaution, sous conditions strictes de stérilité pour éviter toute contamination et avec du matériel à usage unique.

En l'absence d'épanchement, le prétraitement des échantillons tissulaires ou de prothèse est fondé sur le broyage des prélèvements et/ou la sonication des matériels explantés.

L'objectif est de libérer les bactéries incluses dans le biofilm qui adhèrent fortement au matériel.

Le broyage peut être réalisé à l'aide de dispositifs stériles vendus dans le commerce ou de billes de verre stérilisées ou de mortiers stérilisés. La sonication des implants est réalisée dans un bain à ultrasons avec un support scelle contenant le liquide de sonication et l'implant retiré.

L'application d'ultrasons à basse fréquence permet de détacher le biofilm de la surface et de le casser sans altérer la viabilité des bactéries.

 Analyse du liquide articulaire :

La ponction a pour objectif l’analyse du liquide articulaire. De façon systématique, ce liquide justifiera plusieurs types d’analyses :

• L’examen macroscopique

• L’examen cytologique (numération et typage des cellules) • La recherche de microcristaux

• L’examen direct

 Examen macroscopique :

En fonction de la couleur, la limpidité et la viscosité, l’examen macroscopique donne une orientation diagnostique.

Le liquide synovial normal est pâle (synovial signifie comme du blanc d’œuf), translucide et très visqueux.

L’opacité du liquide est fonction de sa densité cellulaire.

Un liquide lactescent est en général purulent ; un liquide floconneux et huileux dénote la présence de cristaux de cholestérol.

Un épanchement hémorragique oriente vers une hémarthrose qui traduit une agression aigue de la synoviale et/ou un trouble de la coagulation.

Dans l’hémarthrose, le liquide articulaire ne coagule pas, ce qui permet de le différencier d’un liquide hémorragique dû à un accident de ponction qui lui est coagulable.

La viscosité diminue en fonction de l’inflammation, le taux d’acide hyaluronique diminuant nettement dans les maladies inflammatoires.[56]

En cas d’arthrite septique, le liquide est trouble voire purulent.

Figure 12: Aspect macroscopique d’un liquide articulaire normal [57]

 Examen Cytologique :

De l’examen cytologique du liquide articulaire découle un véritable aiguillage étiologique.

Le liquide synovial normal est pauvre en cellules, le nombre de leucocytes est normalement inférieur à 1000/mm3;

En cas d'augmentation de ce nombre, à côté d'une infection, il existe de nombreuses autres étiologies : arthrite microcristalline, inflammatoire, traumatique ou mécanique.

En cas d’arthrite septique, le résultat attendu est au-dessus de 50 000 éléments/ mm³, avec au moins 90 % de cellules polynuclées; Mais le liquide peut contenir moins de 25 000 éléments/mm³ dans 12 à 41 % des cas . Un liquide peu cellulaire n’exclut donc pas une arthrite septique.[58]

La formule leucocytaire peut donner une orientation étiologique : une prédominance neutrophile est souvent d’origine bactérienne alors qu’une prédominance lymphocytaire oriente à une mycobacteriose en priorité.

 Examen des cristaux :

La recherche de cristaux, qui devrait être systématique, permet un diagnostic rapide d’arthropathie microcristalline.

L’examen microscopique en lumière polarisée permet l’identification des microcristaux par leur forme et surtout par leur pouvoir de déviation de la lumière (biréfringence).

Ils peuvent être intra ou extracellulaires: • cristaux d’acide urique (goutte)

• cristaux de pyrophosphate de calcium (chondrocalcinose) • cristaux de cholestérol.

D’autres cristaux (cristaux d’hydroxyapatite) peuvent être trouvés, mais ces derniers ne sont pas détectés en microscopie optique.

Suite à une injection, des cristaux de corticoïdes responsables de poussées inflammatoires peuvent être observés durant plusieurs mois.

 Examen direct :

Il montre une faible sensibilité (environ 10 %) alors que la spécificité est proche de 100 %.

L'examen direct d'un frottis après coloration de Gram permet généralement de rechercher la présence de polynucléaires neutrophiles (PNN) et de bactéries .

On élabore le frottis coloré au Bleu ou MGG pour la formule leucocytaire et la coloration de Gram pour mettre en évidence la présence de bactéries.

D’autres colorations telles qu’au Ziehl et à l’Auramine peuvent avoir une orientation clinique.

Tableau 6: Principales caractéristiques du liquide synovial normal et pathologique[56]

 Mise en culture :

L'ensemencement de deux géloses au sang (l'une incubée en aérobiose et l'autre en anaérobiose), d'une gélose au sang cuit incubée sous 5 % de CO2 et d'un milieu liquide de type bouillon Schaedler est nécessaire à la recherche des différents pathogènes.

Des flacons d'hémocultures peuvent également être ensemencés.

Une incubation pendant 14 jours à 35 °C permettra l'isolement de variantes métaboliques cultivant sous forme de microcolonies (appelées Small Colony

Variant [SCV]), de bactéries de croissance lente (par exemple Propioni bacterium acnes) et d'infections polymicrobiennes.

La prolongation des cultures à 14 jours permet d'augmenter la sensibilité de la culture.

 Lecture des cultures :

La lecture des géloses doit être réalisée à J1, J2 et J5 (et J10 pour la gélose anaérobie) avec une lecture régulière des milieux liquides jusqu'à J14.

Ces derniers seront systématiquement repiqués dès qu'un trouble apparait ou à J14, même s'ils ne sont pas troublés.

La lecture des géloses doit être attentive à la recherche des différents aspects de colonies.

Une culture positive précoce ne dispense pas des lectures suivantes et d'une incubation complète à la recherche de bactéries à croissance plus lente.

 Interprétation :

Pour les infections aigues, l'interprétation des résultats ne pose habituellement pas de problème, sauf si le patient est sous antibiotique au moment des prélèvements; dans ce cas, les techniques de biologie moléculaire constituent une bonne alternative.

En général, les cultures se positivent rapidement et les bactéries en cause n'entrainent pas de problème d'identification et d'antibiogramme.

Inversement, le diagnostic en cas d'infections chroniques est souvent tardif et plus complexe; les germes impliqués étant en petite quantité et ayant le plus souvent une croissance ralentie, une morphologie atypique et des caractères biochimiques inhabituels d’où nous avons un risque d'erreur d'identification et d'interprétation plus important.

L'interprétation des résultats bactériologiques doit tenir compte également des données clinico-biologiques, des espèces identifiées, de la nature et du nombre de prélèvements positifs, et également pour ces derniers du nombre de milieux positifs et de colonies observées.

Les conclusions reposent sur l'étude de plusieurs prélèvements profonds, ainsi, la probabilité d'infection augmente avec le nombre de prélèvements positifs en culture avec la même bactérie.

Du fait de la sensibilité de la culture, la négativité des prélèvements n'exclut pas le diagnostic ; Dans tous les cas, ce n'est qu'au terme d'une confrontation multidisciplinaire que le diagnostic final doit être retenu et la conduite à tenir décidée.

 Identification par Galerie Api20 streptocoque :

API 20 Strep est un système standardisé qui permet de faire un diagnostic de groupe ou d'espèce pour la plupart des streptocoques, entérocoques et pour les germes apparentés les plus courants. Elle comporte 20 microtubes contenant les substrats déshydratés pour la mise en évidence d'activités enzymatiques ou de fermentation de sucres.

Les tests enzymatiques sont inoculés avec une suspension dense, réalisée à partir d'une culture pure, qui reconstitue les milieux. Les réactions produites pendant la période d'incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l'addition de réactifs.

Les tests de fermentation sont inoculés avec un milieu enrichi (contenant un indicateur de pH) qui réhydrate les sucres. La fermentation des carbohydrates entraîne une acidification se traduisant par un virage spontané de l'indicateur coloré.

La lecture de ces réactions se fait à l'aide du Tableau de lecture et l'identification est obtenue à l'aide du Catalogue Analytique ou d'un logiciel d'identification.[59]

Figure 13: Identification par galerie Api 20 strep[60]

 Autres techniques d’identification :

L'identification biochimique peut être mise en défaut pour certaines souches de SCV (Small Colony Variant)et de bactéries anaérobies, mais que la spectrométrie de masse MALDI-TOF est très fiable.

Dans certains cas, l'identification moléculaire (séquençage du gène codant pour l'ARNr 16S ou des gènes sodAou rpoB) est nécessaire, mais cette technique est généralement réalisée par des laboratoires spécialisés.

Du point de vue microbiologique, l'arthrite à pneumocoque est confirmée si isolement d'un germe avec des éléments de l'analyse microbiologique en faveur d'une infection :

‐ L’aspect des colonies

‐ L’identification par une galerie Api20strep ‐ La sensibilité à l’optochine

Figure 14: Logigramme décisionnel pour l’analyse d’un liquide articulaire ou d’épanchement [44]

 Identification des germes :

Les germes principalement rencontrés sont des Cocci à Gram Positif (staphylocoques, streptocoques, etc.), des Bacilles à Gram Négatif (entérobactéries, etc.) et des anaérobies, mais de nombreux autres germes peuvent être rencontrés.[44]

Les germes en cause dépendent du type de l'infection. (Tableau 7)

Tableau 7: Principaux germes isolés en fonction du type d’infection ostéoarticulaire et de l’âge du patient.[44]

 Antibiogramme :

La méthode la plus largement utilisée pour déterminer la sensibilité d’une espèce bactérienne à un panel d’antibiotiques.

L’antibiogramme de référence se fait en milieu gélosé Mueller-Hinton additionné de 5% de sang de cheval défibriné et de 20 mg/L de β NAD.

La lecture des diamètres d’inhibition permet de définir 3 catégories cliniques :

‐ Sensible (S) : Le diamètre d’inhibition mesuré est supérieur ou égale au diamètre critique supérieur « D ».

‐ Résistant (R): Le diamètre d’inhibition mesuré est inférieur strict au diamètre critique inférieur « d »

‐ Intermédiaire (I) : Le diamètre critique mesuré est inférieur au diamètre supérieur D et supérieur ou égal au diamètre inférieur « d »

Le CASFM (Comité de l’antibiogramme de la Société Française de Microbiologie) publie chaque année, en collaboration avec l’EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing), des recommandations pour l’interprétation des profils de sensibilités des principales espèces bactériennes rencontrées en bactériologie clinique, et définit les listes standard et complémentaire des antibiotiques à tester pour l’étude de

Tableau 8: Listes standard et complémentaire des antibiotiques à tester pour

S.pneumoniae[61]

 Concentration minimale inhibitrice (CMI) :

C’est la méthode de recours en cas de PSDP (pneumocoque de sensibilité diminuée à la pénicilline). Elle se définit comme la plus faible concentration d’antibiotique nécessaire à l’inhibition de toute croissance bactérienne visible in vitro. [62]

C’est une valeur quantitative, exprimée en mg/L, qui peut être interprétée de manière qualitative, définissant ainsi trois catégories cliniques :[61]

‐ Sensible (S) : la CMI est inférieure ou égale à la concentration critique basse «c» qui correspond aux concentrations sériques attendues avec des posologies usuelles. La probabilité de succès thérapeutique est forte.

‐ Résistant (R) : la CMI est strictement supérieure à la concentration critique haute «C ». La probabilité d’échec thérapeutique est forte.

‐ Intermédiaire (I) : la CMI est strictement supérieure à la concentration critique basse«c» mais inférieure ou égale à la concentration critique haute « C ».

La technique de référence pour la détermination des CMI de S. pneumoniae est la méthode de dilution en milieu gélosé.

D’autres techniques sont également disponibles comme la méthode des E-tests ou encore la méthode de dilution en milieu liquide sur des microplaques de 96 puits.

Les milieux utilisés sont des géloses ou des bouillons Mueller-Hinton additionnés de 5% de sang de cheval défibriné et de 20 mg/L de β NAD.

 Hémocultures :

Environ 50% des patients ayant une arthrite septique ont des hémocultures positives ; Elles sont systématiques et répétées à chaque pic fébrile devant une arthrite fébrile (›38,5°), autant importantes que la ponction articulaire pour l’isolement du germe causal.

En fonction du contexte (patient immunodéprimé, suspicion de tuberculose...), des hémocultures sur milieux spécifiques seront demandées.[54]

 Le sérotypage / sérogroupage:

Le sérotypage ou sérogroupage a surtout un intérêt épidémiologique, dans le cadre de la surveillance des infections à pneumocoque et leur résistance aux antibiotiques.

L’identification des sérotypes permet l’étude des souches invasives du

Elle se fait par Méthodes conventionnelles ou par Biologie moléculaire. En 2018, le CNRP a évalué une nouvelle technique permettant le typage capsulaire des pneumocoques : La Spectrométrie en infra-rouge FT-IR ( Fourier Transformation-Infrared Spectroscopy) . Il s’agit d’une technique permettant l’analyse de la composition des polyosides capsulaire.[63]