Le devis de l’étude et les tests statistiques retenus

Les analyses statistiques sont réalisées sous la direction du Docteure Yvette Bonvalot, PhD, Biomathématicienne/Biostatisticienne – Épidémiologiste, Spécialiste en évaluation des risques toxicologiques du programme de la santé environnementale à Santé Canada et Professeure adjointe de clinique et chercheure associée de la Chaire en analyse et gestion des risques toxicologiques, au sein du département de Santé environnementale / Santé au travail de la Faculté de médecine, Université de Montréal.

Les analyses statistiques sont effectuées avec le logiciel SPSS, version 17.0 pour Windows (SPSS inc., Chicago, IL, États-Unis), ainsi qu’avec le tabulateur Excel de la suite Microsoft Office 2007 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, États-Unis). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative.

Afin de définir l’approche statistique requise dans ce travail de recherche, la nature de chacun des facteurs et des variables est définie.

• Les conditions d’exposition au BaP sont de type numérique. Comme une étendue de concentrations de BaP est utilisée (trois ou quatre concentrations de BaP par biomarqueur), cette variable est traitée comme une variable continue dans la majorité des analyses.

• Les adduits BPDE-ADN et les BSB à l’ADN sont des données quantitatives continues.

• Les ÉCS, les AC et les MN sont des données quantitatives discrètes, de type compte.

• Le sexe est une variable qualitative catégorielle.

Les statistiques descriptives suivantes sont effectuées pour chacun des biomarqueurs, tant au niveau individuel qu’au niveau du groupe : moyenne, écart-type (SD) et erreur standard de la moyenne (SEM).

Afin d’effectuer la comparaison des différentes conditions d’exposition au BaP au niveau individuel, l’unité expérimentale (la culture ou la cellule) est définie pour chacun des biomarqueurs. Lorsque la culture constitue l’unité expérimentale (deux cultures sont analysées par sujet), il n’est pas possible d’effectuer des comparaisons statistiques au niveau individuel. C’est le cas pour trois biomarqueurs (adduits BPDE-ADN, AC et MN). Par exemple, lors de l'analyse des AC, une seule donnée est obtenue par culture, soit le nombre d'AC observées dans les 100 cellules analysées de cette culture. Pour les deux autres biomarqueurs (les BSB à l’ADN et les ÉCS), « la cellule » constitue l’unité expérimentale. Ainsi, pour l'analyse des BSB à l'ADN sur les métaphases (n = 10) ou sur les noyaux interphasiques (n = 20), de même que pour l'analyse des ÉCS (n = 50), chaque cellule analysée génère une donnée. L’ANOVA à un critère (one way ANOVA) est le test de choix lorsque des nombres équivalents de mesures sont effectués à toutes les conditions d’exposition. Les différentes conditions d’exposition au BaP constituent des facteurs indépendants, distincts les uns des autres. L’utilisation des tests post-hoc (comparaison

multiple) permet de déterminer quelles concentrations diffèrent des autres. Lorsque les variances sont égales, le test post-hoc de Bonferroni est effectué. Lorsque les variances sont inégales, le test post-hoc T2 de Tamhane est effectué.

Lors de la comparaison des différentes conditions d’exposition au BaP au niveau du groupe, l’unité expérimentale est le sujet. Comme chaque sujet est testé pour chacune des conditions d’exposition, on dit que des mesures répétées sont effectuées sur les sujets. Le facteur «concentration de BaP» est donc un facteur de type «intra-sujet», puisque la réponse génotoxique est mesurée à différentes concentrations pour un même individu. Dans cette étude, seul le facteur «sexe» est évalué comme facteur «inter-sujet», puisque des sujets différents font partie des deux groupes analysés (hommes et femmes). Comme nous devons tester un effet intra-sujet et un effet inter-sujet, le test statistique retenu est l'ANOVA pour mesures répétées. Les biomarqueurs mesurés chez les sujets sont traités de façon indépendante et font donc l’objet d’analyses statistiques séparées. Ce type d’ANOVA a été préféré à la MANOVA en raison de la nature exploratoire des analyses statistiques effectuées et également en raison des tailles d’échantillon inégales pour les différents biomarqueurs sélectionnés dans cette étude. Finalement, comme le devis de l’étude implique des mesures répétées effectuées sur un même sujet, le respect de cet aspect est prépondérant dans le choix de l’approche statistique utilisée.

L’ANOVA pour mesures répétées est valide lorsque la sphéricité des données est respectée. Lorsque les variances des différences entre chacune des conditions d’exposition sont similaires, cela veut dire que les sujets répondent toujours de la même façon à l'exposition. Nous disons donc que la sphéricité est respectée. Le test de sphéricité de Mauchly est réussi lorsque la valeur de p qui lui est associée est supérieure à 0,05. Lorsque ce n’est pas le cas et que le test de Mauchly échoue, les corrections

ε

de Greenhouse- Geisser (G-G) et Huynh-Feldt (H-F) sont utilisées pour corriger les valeurs de F. L’assomption de sphéricité est vérifiée en utilisant les corrections

ε

de la façon suivante. Tout d’abord, la moyenne des deux valeurs

ε

de G-G et H-F est calculée. Ensuite, si la moyenne des ε > 0,9 la condition de sphéricité est satisfaite et les résultats du test ANOVA pour mesures répétées sont valides. Si la moyenne des

ε

est dans l’intervalle 0,7 – 0,9 alors la sphéricité est corrigible et la valeur de p du test des effets intra-sujets est celle associée

aux corrections G-G et H-F. Le test ANOVA pour mesures répétées est valide. Finalement, dans le cas où

ε

< 0,7 la sphéricité est non corrigible. Il y a violation de la condition de sphéricité et le test d’ANOVA pour mesures répétées n’est pas valide.

Une seconde approche est alors retenue pour effectuer la comparaison des différentes conditions d’exposition au BaP au niveau du groupe et c’est un test non- paramétrique qui est retenu, comme ce qui est très fréquemment fait dans la littérature pour des études de génotoxicité humaine in vitro. Plusieurs études évaluent leurs biomarqueurs sur quelques sujets (typiquement de un à quatre sujets) qui sont analysés avec une ANOVA à un critère lorsqu’il y a un seul sujet [Gajski et coll., 2007; Alves dos Santos et coll., 2008; Amahdar et coll., 2009]. Le test de Kruskall-Wallis, le test exact de Fisher (unilatéral), ainsi que le test Chi-deux (χ2_{), tous trois pour des échantillons indépendants, sont fréquemment} sélectionnés lorsqu’il y a quelques sujets [Digue et coll., 1999; Gonzalez Borroto et coll., 2001; Abou-Eisha et coll., 2004; Zeljezic et Garaj-Vrhovac, 2004; Kopjar et coll., 2006; Tellez et coll., 2007; Mamur et coll., 2010]. Quelques études effectuées avec un plus grand nombre de sujets tiennent compte de l’effet intra-sujet et utilisent un test non-paramétrique pour des échantillons appariés comme le test de Friedman [Donmez-Altuntas et coll., 2003; Donmez-Altuntas et coll., 2007]. Par contre, ce test ne permet pas de déterminer où se situent les différences entre les conditions d’exposition au BaP, ce qui requiert l’utilisation d’un test additionnel. Dans les autres cas, un test t de Student, sans autre précision [Yuzbasioglu et coll., 2006; Celik et coll., 2007; Celik et coll., 2009; Yilmaz et coll., 2009] ou encore pour échantillons appariés [Testa et coll., 2004] est sélectionné.

Dans notre étude, la violation de la sphéricité des données indique que des variations existent au sein des sujets dans la façon dont ils répondent au BaP. Il faut en tenir compte dans le choix du test non-paramétrique et sélectionner un test pour des échantillons appariés. Le test des rangs signés de Wilcoxon a été choisi pour évaluer l’effet intra-sujet de la concentration de BaP. Il permet d’évaluer l’effet de la concentration de BaP sur les indicateurs évalués, en appariant les données de chacun des sujets, puis de déterminer où se situent les différences entre les conditions d’exposition au BaP, car les conditions d’exposition au BaP sont comparées par paires. Ce test a également été utilisé dans une autre étude de génotoxicité humaine in vitro [Rosefort et coll., 2004].

Par la suite, l’analyse de l’effet du sexe (effet inter-sujet) sur les indicateurs analysés est effectuée avec le test t de Student pour des échantillons indépendants (bilatéral) [Triola et Triola, 2006]. Une seconde approche pour évaluer l'effet du sexe est également utilisée. Cette approche vise à comparer la relation dose-réponse d'un biomarqueur donné obtenue dans le groupe d'hommes, et à la comparer à la relation-dose réponse obtenue dans le groupe des femmes. Cette approche vise à comparer l'intensité de la réponse génotoxique obtenue chez les deux sexes.

Le test z de deux proportions indépendantes a été sélectionné pour comparer la fréquence d’apparition d’une caractéristique donnée (comme par exemple les cassures chromatidiennes ou les MN comportant des centromères) au sein de deux groupes différents (conditions d’exposition ou sexes). Pour effectuer ce test, nous devons connaître la proportion de la caractéristique d’intérêt dans les deux groupes comparés et la population totale (p1, p2 et p), ainsi que le nombre de caractéristiques de chaque groupe et de la population totale (n1, n2 et n).

La formule mathématique suivante est ensuite appliquée, en sachant que p + q = 1 : z = (p2 – p1)/ √ (pq/n1 + pq/n2)

La valeur de z est ensuite recherchée dans une table de distribution normale centrée réduite, ce qui permet de déterminer la valeur de p qui lui est associée. Une valeur de p inférieure à 0,05 permettra donc de conclure que la proportion de la caractéristique étudiée est différente entre les deux groupes comparés. Le test z de deux proportions indépendantes est valable lorsque de grands groupes sont comparés. Cette validation se fait en vérifiant que tous les produits (np, n1p, n2p, nq, n1q et n2q) sont supérieurs ou égaux à cinq [Schwartz, 1986].

Dans le document Évaluation de la cytogénotoxicité humaine induite par l’exposition à de faibles doses de benzo-a-pyrène, à l’aide de biomarqueurs précoces (Page 167-171)