Détermination des paramètres à vérifier et mise au point du plan expérimental

D’après les recommandations du SH GTA 04 – Révision 00 que nous avons vu dans la partie méthodologie (Tableau 2, page 33), les paramètres à vérifier pour la validation d’une méthode qualitative étaient : la sensibilité diagnostique et la spécificité analytique, la comparaison avec une méthode de référence et/ou une autre méthode utilisée au laboratoire, la contamination inter-échantillons, la robustesse et la stabilité des réactifs. Bien que non recommandée nous avons souhaité procéder également à une comparaison inter-laboratoires.

a) Sensibilité diagnostique et spécificité analytique Définition :

La sensibilité diagnostique d’une méthode est la probabilité que le résultat soit positif si la condition recherchée est présente.

La spécificité analytique ou « sélectivité » est l’aptitude d’une méthode à mesurer l'analyte ou la caractéristique recherchée sans interférence de la part des autres constituants de l'échantillon.

Méthode :

La coloration histologique standard en tant que telle ne peut pas faire l’objet d’un calcul de sensibilité ni de spécificité, d’une part car il n’y a pas de matériau de référence et d’autre part car ce n’est pas une condition ou une caractéristique en particulier qui est recherchée. La technique permet en effet d’observer une multitude de caractéristiques morphologiques des cellules et des tissus, qui pourront ensuite être interprétées.

issues du même bloc avec uniquement de l'hémalun, uniquement de la phloxine et uniquement du safran, afin de vérifier que chaque colorant colore uniquement les structures qu’il est sensé colorer.

Pour la sensibilité, nous avons utilisé le résultat obtenu à l’EEQ de l’AFAQAP pour la coloration histologique standard en 2014, en considérant qu’un bon résultat à ce test montrait que les couleurs étaient là où elles étaient attendues.

b) Comparaison des méthodes Définition :

La comparaison des méthodes consiste à comparer la méthode à valider avec une méthode de référence ou avec une autre méthode utilisée au laboratoire.

Méthode :

Dans le cas de la coloration standard en histologie, il n’existe pas de méthode de référence. Le laboratoire disposant de 2 automates de coloration, la comparaison a consisté en 30 échantillons de tissus sains et pathologiques coupés en double

exemplaire, chaque exemplaire étant ensuite coloré sur l’un des 2 automates, en même

temps. Les 60 lames devaient ensuite être appréciées de façon indépendante par 3 pathologistes du service, en utilisant la grille d'évaluation de la qualité de la coloration et la limite d’acceptabilité fixée. Ainsi, une lame était acceptée si elle obtenait une évaluation A ou B par les 3 pathologistes observateurs ; elle était rejetée dans le cas contraire. La concordance des 2 méthodes était évaluée sur le critère lame « acceptée » ou « rejetée ».

c) Contamination inter-échantillons Définition :

« Des phénomènes de contamination entre échantillons peuvent être observés lors de l’utilisation de systèmes analytiques. Une étude de contamination inter-échantillons est à effectuer pour tous les systèmes automatisés. » (SH GTA 04 (19))

Méthode :

1 lame test / 1 lame de routine, etc.). Une colonne spécifique permettait ensuite aux observateurs de signaler une contamination inter-échantillons lors de l'évaluation.

d) Robustesse Définition :

« La robustesse d’une procédure d’analyse est une mesure de sa capacité à ne pas être affectée par des variations faibles, mais délibérées, des paramètres de la méthode. La robustesse fournit une indication sur la fiabilité de la méthode dans les conditions normales d'utilisation. Ces variations, faibles, correspondent à l’écart d’un paramètre opératoire par rapport à sa valeur nominale définie dans la méthode.» (SH GTA 04 (17)). Méthodes :

L'étude de la robustesse a portée sur les variations suivantes :

- Phase pré-analytique différente : le laboratoire reçoit des demandes d’avis d’autres laboratoires souvent accompagnées d’un bloc de tissu représentatif. Le pré- traitement de ces échantillons n’est pas maîtrisable par le laboratoire et le plus souvent inconnu. Afin d’évaluer l’impact de ce paramètre, nous avons choisi de couper et colorer 10 blocs provenant d’autres laboratoires.

- Durée de conservation des lames blanches : dans le laboratoire, les lames blanches peuvent être conservées pendant un mois au réfrigérateur (entre +2 et +6°C). Nous avons coupé et coloré 5 lames blanches issues du même bloc, conservées au réfrigérateur et colorées à J1, J7, J14, J21, et J28.

- Durée de fixation différente : La durée de fixation appliquée dans le laboratoire est de 6 heures minimum pour les biopsies, 24 à 48 heures pour les petites pièces opératoires et 48 à 72 heures pour les pièces opératoires plus volumineuses.

Néanmoins, les durées de fixation peuvent être allongées dans le cas d’un week-end

ou jour férié. Pour évaluer l’impact de la variation du temps de fixation sur le rendu de coloration, nous avons sélectionné à l’état frais 6 échantillons de la même pièce opératoire qui ont été fixés pendant 5, 29, 41, 77, 101 heures et 7 jours.

- Epaisseur de coupe : Les coupes pour coloration standard sont réalisées à 3 microns. Nous avons décidé de couper et colorer 4 lames d’un même bloc à 2, 3, 4 et 5 microns.

- Température ambiante : La température du laboratoire est maîtrisée grâce à un système de climatisation. Néanmoins, le laboratoire étant situé dans le sud de la France, la température ambiante est susceptible de varier de quelques degrés entre les mois d’été et d’hiver. Pour vérifier l’influence de ce paramètre, nous avons comparé les résultats des CIQ quotidiens des 2 premières semaines d’août 2014 et des 2 premières semaines de février 2015.

- Opérateur de la technique : Seuls les techniciens formés et habilités au poste de coloration sont opérateurs de la technique. La coloration est réalisée chaque semaine par différents techniciens, selon un planning permettant de tracer l’opérateur. Afin d’objectiver une éventuelle différence de qualité inter-opérateurs, nous avons analysé de façon rétrospective les dysfonctionnements signalés en 2014, en fonction du planning technique.

- Taille des lames : dans certains cas, les prélèvements réalisés en macroscopie sont inclus dans des blocs de plus grande taille (« méga blocs ») et les coupes sont ensuite positionnées sur des plus grandes lames, dites « grandes lames » ou « méga lames ». Ces grandes lames étant uniquement colorées par cet automate, nous n’avons pas pu faire de comparaison des méthodes et nous avons inclu la taille de la lame dans l’analyse de robustesse. Nous avons sélectionné 3 échantillons de grande taille, puis évalué ces lames selon les critères de qualité habituels.

e) Stabilité des réactifs Définition :

Etudier la stabilité des réactifs consiste à évaluer si les réactifs « embarqués » dans un automate sont stables au cours du temps.

Méthode :

Les colorants sont changés une fois par semaine et les autres bains (alcool, histolemon…) quotidiennement. Le laboratoire réalise déjà une veille constante de la stabilité des réactifs grâce au passage quotidien d’un CIQ.

Pour le dossier de validation de méthode nous avons ré-évalué les lames de CIQ quotidiens de 4 semaines consécutives pour objectiver une éventuelle différence de qualité en fonction de la durée de conservation des réactifs.

f) Comparaison inter-laboratoires

Bien que non exigée dans un dossier de validation, une comparaison inter-laboratoires a été réalisée. La comparaison a consisté en 8 échantillons de tissus sains et pathologiques coupés en 4 exemplaires. Deux exemplaires ont été colorés au laboratoire par les deux automates. Les 2 autres exemplaires ont été confiés à 2 autres laboratoires d’ACP, l'un dans le secteur privé et l'autre dans le secteur public.