Détermination des caractéristiques de la méthode et description a) Caractéristiques

Le processus analytique commence une fois que le prélèvement a été reçu, enregistré et acheminé jusqu’en salle de cytologie. Il se fini une fois que la lame a été assemblée et prête à être interprétée.

Le processus analytique comprend 3 sous-processus réalisés à l’aide de trois automates différents :

- les cellules sont étalées par un processeur ThinPrep™ 2000 de HOLOGIC®,

- la lame est colorée dans un automate de coloration DRS 2000® de Sakura®,

- la lame est assemblée avec une lamelle dans un automate Tissue-Tek® Film®

Sakura®.

Il s’agit d’une méthode qualitative puisque le résultat n’apporte pas d'information sur une quantité mais sur la morphologie des cellules d'un échantillon permettant d’en réaliser une analyse cytologique.

Les « analytes » sont les cellules recueillies lors du prélèvement et fixées dans une solution de conservation PreservCyt® (formulée à base de méthanol et d’eau).

La finalité de la méthode est le dépistage des lésions pré-invasives ou des cancers du col de l’utérus à un stade précoce.

La première et la troisième étape sont réalisées en suivant scrupuleusement les recommandations fournisseurs et relèveraient d’une vérification des méthodes (portée A), tandis que la seconde étape de coloration est réalisée selon un protocole mis au point par le service et relève donc d’une validation (portée B). Néanmoins, ces 3 étapes sont interdépendantes puisqu’il n’est pas possible de vérifier les performances de la technique monocouche sans procéder à la coloration de la lame et, inversement, la validation de la technique de coloration nécessite forcément un étalement préalable. Par ailleurs, une lame ne peut pas être observée si elle n’est pas assemblée.

Ainsi, même si le processus analytique comporte 3 sous-processus, il est impossible de vérifier/valider chacun de manière indépendante. Aussi nous nous plaçons dans le cas

d’un processus simple, avec un périmètre d’accréditation selon une portée flexible étendue de type B.

b) Description des sous-processus : Etape 1 : Etalement par méthode ThinPrep PapTest

Cette technique a été introduite en 1996 par le laboratoire Hologic.

Elle commence par un prélèvement effectué avec un dispositif de prélèvement cervical CervexBrush. Ce prélèvement est immergé et agité dans un flacon pré-rempli de 20 ml de solution PreservCyt. Le flacon contenant l’échantillon est ensuite fermé, étiqueté et envoyé au laboratoire.

Au laboratoire, le flacon est placé dans le processeur ThinPrep 2000 où une dispersion douce désagrège le sang, le mucus et les débris impropres au diagnostic, et mélange les cellules de l’échantillon. Les cellules sont ensuite recueillies sur un filtre. Le processeur contrôle le débit à travers le filtre pendant le recueil des cellules, de façon à obtenir un nombre de cellules adéquat. Une fine couche de cellules est ensuite transférée sur une lame de verre dans un cercle de 20 mm de diamètre et la lame est automatiquement déposée dans une solution de fixation (alcool) (46).

Etape 2 : Coloration

Technique Harris Shorr

Cette coloration a été mise au point par Ephraïm Shorr en 1940 (47). Elle a connu depuis de nombreuses variantes qui ont permis d’augmenter son efficacité et de faciliter sa mise en pratique. Elle est couramment employée en cytologie et associe :

 un colorant nucléaire, l’hématoxyline de Harris, associant de l’hématoxyline et du sulfate d’aluminium, qui colore les noyaux des cellules grâce à son affinité avec l’ADN ;

 un colorant nucléo-cytoplasmique, le colorant de Shorr composé lui-même de 3 colorants (Orange G, vert solide et Biebrich écarlate).

Les cellules basophiles apparaissent bleues, et les cellules acidophiles rouges/orangées.

Technique de Papanicolaou

Mise au point par Geórgios Nikoláou Papanikoláou en 1942 (48), elle permet de différencier les cellules en fonction de leur maturité et de leur activité métabolique. C’est la coloration la plus utilisée pour la cytologie gynécologique.

Elle utilise trois colorants, un colorant nucléaire et 2 cytoplasmiques :

l’hématoxyline de Harris,

l’Orange G, colorant acide, réagit avec les cellules squameuses matures de par son affinité avec la kératine,

l’Eosine-Azur, colorant acide polychrome (contenant de l’éosine, du vert lumière et du brun de Bizmark), réagit avec le cytoplasme des cellules squameuses immatures (basales et intermédiaires), les cellules glandulaires et les hématies. Ainsi, une fois colorés :

les noyaux apparaissent en bleu/noir,

les cytoplasmes des cellules non kératinisées sont colorés en bleu/vert (cellules des couches profondes),

les cytoplasmes des cellules kératinisées apparaissent en rose/orange (cellules superficielles),

Etape 3 : Assemblage des lames

Les lames sont déshydratées grâce à des bains de xylène, puis un film de verre est collé afin de préserver les préparations.

5. Recherches bibliographiques

Les recherches bibliographiques ont été réalisées à partir des manuels fournisseurs, d'Internet et de la base de données PubMed.

Concernant l’étape d’étalement monocouche et le montage des lames, le laboratoire suit les recommandations d’utilisation des fournisseurs (manuels d’utilisation et d’entretien des automates, fiches des réactifs et consommables).

Concernant la technique de coloration, la méthode a été mise au point en utilisant les données fournisseur pour l’utilisation de l’automate et des protocoles utilisés par d’autres laboratoires qui ont été adaptés par le service, à la suite de nombreux essais.

L’organisation général du service respecte déjà les recommandations de l’AFAQAP :

RBPACP (12) et Gestion d’une structure ACP (13).

Les recommandations françaises concernant l’assurance qualité en cytopathologie gynécologique sont relativement anciennes puisqu’elles ont été éditées en 1988 (49). Nous avons donc consulté également les Directives concernant la pratique et

l’assurance qualité en cytopathologies de la Société Canadienne de Cytologie (50) et les Recommandations européennes pour l’assurance qualité pour les cytologies cervico- utérines (38).

La définition de critères objectifs pour l’évaluation de la qualité de la technique s’est appuyée sur les critères de l’AFAQAP utilisés lors du programme d’EEQ pour les FCU en 2015 (51).

Les conditions pré-analytiques et la conservation des échantillons et réactifs respectent les recommandations fournisseur (acheminement à température ambiante, conservation 6 semaines).

L’identification des interférences potentielle s’est appuyée sur les recommandations fournisseurs et les recommandations de prélèvements des FCU pour les cliniciens (46,52,53)

Aucune bibliographie n’a été trouvée concernant la contamination inter-échantillons, les performances attendues, ni les objectifs analytiques.

6. Détermination des performances attendues, des limites d’acceptabilité et