Détermination des formules chimiques

Suite à l’étape d’extraction des pics, les formules brutes des métabolites secondaires fongiques ont été déterminées sans ambiguïté. Pour un métabolite donné, les masses mesurées des trois ions correspondants, détectés respectivement dans le spectre de masse non marqué, le spectre de masse 13_{C et le spectre de masse} 13_C15_{N ont en effet permis de connaître le nombre d’atomes de carbone et} d’atomes d’azote que comporte la molécule. La différence de masse entre un atome de carbone 12 et un atome de carbone 13 étant d’une seule unité de masse, le nombre de carbones (NC) a été obtenu par la soustraction du m/z de l’ion entièrement marqué au 13_{C (m/z}

13C) et du m/z de l’ion non marqué (m/z12C).

La quantité d’azote (NN) a quant à elle été déterminée à partir du m/z de l’ion doublement marqué (m/z13C15N) par la formule suivante :

Lorsque le nombre d’atomes de carbone est impair, le nombre d’azotes correspond à l’un des deux entiers qui encadrent le résultat de cette équation et peut être déterminé grâce à la règle de l’azote. La connaissance de la composition en carbone et azote du métabolite a alors permis de filtrer les différentes possibilités de formules brutes pour chacune des trois masses exactes. La confrontation des trois listes de formules chimiques ainsi obtenues a ensuite mis en évidence l’unique formule

commune correspondant à la formule du métabolite secondaire fongique ionisé (exemple en Tableau 4).

Tableau 4. Exemple du calcul de la composition en carbone et en azote de l’ion détecté à m/z12C=553,2814 et détermination de sa

formule brute. Les formules chimiques ont été générées par le logiciel Xcalibur (Thermo Scientific) selon une précision de masse de 5 ppm et en acceptant les compositions chimiques suivantes : carbone (12_{C et/ou} 13_C)

(entre 0et 60 atomes), hydrogène (entre 0et 80 atomes), azote (14_{N ou} 15_{N) (entre 0 et 25}

atomes), oxygène (entre 0 et 25 atomes), sodium (entre 0et 2 atomes), phosphore (entre 0et 9 atomes), soufre (entre 0et 10 atomes), fluor (entre 0et 16 atomes), chlore (entre 0et 10 atomes), brome (entre 0et 5 atomes) et silicium (entre 0et 8 atomes).

Afin de faciliter cette étape de détermination des formules brutes, le logiciel MassToFormulaCompare a été précédemment développé au sein du laboratoire. Il permet le calcul des formules possibles à partir des trois masses exactes renseignées par l’utilisateur (Figure 20A) en considérant le marquage isotopique et les compositions atomiques minimales et maximales suggérées (Figure 20B). La confrontation de ces trois listes permet de définir l’unique formule commune et donc de connaître la composition chimique de la molécule étudiée (Figure 20C).

Figure 20. Utilisation du logiciel MassToFormulaCompare pour la détermination de la formule chimique d’un composé à partir du m/z de l’ion non marqué (ici 511,2909), de l’ion marqué 13_{C (ici 539,3837) et de l’ion}

doublement marqué 13_C15_{N (ici 529,3242). A. Rapports m/z renseignés par l’utilisateur. B. Compositions chimiques}

Les formules chimiques générées par MassToFormulaCompare sont soumises aux sept règles d’or émises par Kind et Fiehn2_{. Ces règles sont fondées sur la répartition des éléments chimiques dans} la nature et la composition générale des molécules naturelles. Elles permettent ainsi de restreindre le nombre de formules chimiques possibles pour une masse exacte observée en spectrométrie de masse :

(1) Restriction du nombre d’éléments. Seuls les éléments constituant les molécules naturelles ou résultant des conditions analytiques utilisées au sein du laboratoire sont considérés. Les quantités maximales pour chaque type d’atomes sont limitées par la quantité maximale observée dans les bases de données de produits naturels (Dictionary of Natural Products et Wiley mass spectral). Ainsi, une molécule de 500 Da ne pourra pas comporter plus de 39 atomes de carbones, 72 atomes d’hydrogènes, 20 atomes d’azote, 20 atomes d’oxygène, 9 atomes de phosphore, 10 atomes de soufre, 16 atomes de fluor, 10 atomes de chlore, 5 atomes de brome et 8 atomes de silicium.

(2) Règles chimiques de Lewis et Senior. Elles prennent en considération la valence des différents éléments et leur ionisation en spectrométrie de masse.

(3) Respect des ratios isotopiques. Les molécules naturelles contiennent les éléments chimiques sous différentes formes isotopiques dont le ratio est déterminé par l’abondance naturelle de chacun des isotopes. Ce ratio influence la masse exacte du composé. Cette règle n’a pas d’impact pour les élément monoisotopiques tels que le sodium, le fluor et le phosphore.

(4) Ratio hydrogène/carbone. L’observation des bases de données de molécules naturelles a montré que 99,7% de ces composés ont un ratio H/C compris entre 0,2 et 3. De rares exceptions sont observées telles que la méthylhydrazine (CH6N2 H/C=6) ou le tetracyanopyrrole (C8HN5 H/C= 0,125).

(5) Ratio hétéroatome/carbone. L’observation des bases de données de produits naturels a démontré que les ratios de quantités d’azote, d’oxygène, de phosphore et de soufre versus de carbone sont compris entre 0 et 1,5. En particulier, l’oxygène et l’azote, qui sont les deux hétéroatomes les plus rencontrés dans la composition des métabolites secondaires fongiques, ont des ratios maximums respectifs de 1,2 et 1,3.

(6) Probabilités de ratios d’éléments. Cette règle permet de considérer la composition globale d’un composé au-delà de la validation des règles 4 et 5 vérifiant les ratios de chaque élément chimique de manière distincte. En effet, la formule C26H28N17O1P3S8 valide les précédentes règles, mais la composition globale est improbable pour une molécule naturelle.

(7) Présence de composés triméthylsilylés. Le groupement triméthylsilyl (TMS), composé de trois groupements méthyl liés à un atome de silicium [-Si(CH3)3], est un groupement utilisé en chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse pour dérivatiser les molécules à analyser. Cette règle n’impacte donc pas les analyses effectuées en LC/MS dans le cadre de cette thèse.

Les données issues des étapes d’extraction des pics, de suppression de la redondance de l’information et de détermination des formules lors de l’analyse du métabolome secondaire de P. verrucosum sont présentées dans l’article 2 en fin de chapitre.