La première information à étudier est la possibilité pour le dioxygène O2de se
dé-placer à l’intérieur de la protéine et de se rapprocher de l’intermédiaire de réaction,
appelé Int et visible dans la figure 13.1. Selon une publication du Prof. Branchini2, la
molécule de O2 passe du solvant à l’intérieur de la protéine par un tunnel que l’on
peut voir Figure 13.3.
Un modèle est créé avec la protéine 4G36 de la luciolePhotonus Pyralisdont on
a inséré le substrat Int dans la cavité. On place artificiellement la molécule de O2à
l’entrée de la cavité, qui correspond au tunnel décrit plus haut. Le modèle est alors
noté 4G36-O2. Le calcul umbrella sampling nous permet d’accéder à la valeur de
l’énergie libre du déplacement de O2dans la protéine. La molécule de O2est placée à
8.5 Å du carbone C1 de Int et alignée de façon à être parallèle au plan du substrat Int.
Les minimisations réalisées avant l’umbrella sampling font apparaître un élément
C
HAPITRE13 : E
TUDE DE L’
ÉTAPE DE COORDINATION DU DIOXYGÈNE LORS DE LA BIOLUMINESCENCEintéressant dans la structure du système. Le résidu Hip 245 situé proche du substrat
Int, forme une liaison de type liaison hydrogène avec le carbanion C1, celui qui porte
la charge négative.
FIGURE13.3 – Représentation du système avant la simulation umbrella sampling et
appelé 4G36-O2. Le substrat Int et la molécule de O2sont représentés sous forme de
bâtons. O2est placé dans un canal joignant le solvant et le site actif de la protéine. La
protéine est représentée en dessinant la surface de cette dernière avec un rayon de
1.4 Ået par la couleur grise.
Le calcul d’umbrella sampling est réalisé en prenant comme distance de réaction
la distance Dumbr el l a correspondant à la distance entre le centre de masse de la
liaison C1-C2 (molécule Int) et le centre de masse de la liaison O1-O2 (molécule O2).
Cette distance varie de 8.5 Å à 1.5 Å avec un pas de 0.2 Å. Le graphique obtenu dans
la figure 13.4 ne présente aucune barrière énergétique le long de la MD. La molécule
de O2 est libre de se déplacer à l’intérieur de la protéine sans apport d’énergie
extérieure. Entre la distance Dumbr el l a valant 8.5 Å à 3.5 Å la molécule de O2 se
rapproche de plus en plus du substrat Int en restant plus ou moins parallèle au plan
du substrat Int incluant la liaison C1-C2. A partir de 3.5 Å lesimagesobtenues durant
la simulation d’umbrella sampling montrent que la molécule de O2 ne s’approche
désormais plus de la molécule Int et reste dans la même conformation pour les 9 pas
restants.
Cette distance de 3.5 Å semble être la distance maximale accessible par une
contrainte mécanique avec une approche classique. Au delà il est nécessaire
d’uti-liser des méthodes quantiques afin de modéd’uti-liser l’approche de la molécule de O2.
La structure obtenue à Dumbr el l avalant 3.5 Å est ensuite extraite et minimisée au
ni-veau MM afin d’obtenir une modèle nommé 4G36-O2-min, visible dans la figure 13.5.
La structure minimisée montre que la stabilisation de O2intervient à une distance
Dumbr el l a égale 3.5 Å. On note la présence de plusieurs liaisons hydrogène reliant le
dioxygène aux résidus environnants, notamment l’Hip 245, le résidu choisi pour être
protoné en échange de la perte d’un hydrogène sur le substrat Int et une molécule
d’eau.
Suite à l’obtention d’une structure stable, la question suivante consiste à savoir si
FIGURE13.4 – Profil de l’énergie libre obtenue lors la simulation umbrella sampling.
lors d’une MD sans contrainte, O2continue à graviter autour de cette position. Ainsi,
5 MD d’une durée comprise entre 30 et 60 ns ont été réalisées. La molécule de O2
est libre de tout mouvement et continue d’explorer le site actif de l’enzyme. O2ne
reste jamais proche du site d’ancrage du substrat Int dans toutes les MD effectuées.
Cependant, O2ne se retrouve jamais de l’autre coté du plan formé par le cycle
thia-zolone et le cycle adénosine du substrat Int. La position de ces deux plans ainsi que
les résidus environnants occupent tout l’espace dans la cavité. Il est alors légitime de
penser que l’attaque de O2ne peut se faire que d’un seul côté du cycle thiazolone du
substrat Int, le côté par lequel la molécule de O2 est arrivée. L’autre observation de
ces MD est que la molécule de O2finit toujours par sortir du site actif puis de la
lucifé-rase pour se retrouver dans le solvant. Deux chemins sont observés quand à la sortie
de O2. Cette molécule peut sortir par le même endroit que son entrée dans la
pro-téine, c’est à dire par le canal entre le domaine N-terminal et le domaine C-terminal.
La deuxième possibilité est de sortir par l’interface entre le domaine C-terminal,
N-terminal et le solvant, la zone étant celle où la luciférine et l’ATP pénètrent dans le
site actif quand le domaine C-terminal est en position ouvert.
Finalement, seule une MD avec une contrainte entre O2et le substrat Int permet de
garder ces molécules proches l’une de l’autre. Suite à l’umbrella sampling, la
minimi-sation de la structure Dumbr el l a = 3.5 Å donne lieu au modèle 4G36-O2-min, le point
C
HAPITRE13 : E
TUDE DE L’
ÉTAPE DE COORDINATION DU DIOXYGÈNE LORS DE LA BIOLUMINESCENCEFIGURE13.5 – Représentation du système après la simulation umbrella sampling et
après la minimisation au niveau MM. Le substrat Int et la molécule de O2sont
re-présentés sous forme de bâtons, le résidu Hip 245 et la molécule d’eau par le modèle
CPK.
de départ des calculs QM/MM réalisés par la suite. L’orientation de la molécule de
O2ne facilite pas la coordination au substrat Int. L’oxygène O2 est bien aligné vers le
carbone C2 mais l’angle formé entre la liaison C2-C1 et l’autre atome d’oxygène O1
est de 73° au lieu de 90° attendu. En outre, l’atome d’oxygène O2 est plus proche du
carbone C2, bien que la formation en premier de la liaison O1 et C1 semble plus
lo-gique. La distance C1-O1 est de 3.77 Å et la distance C2-O2 de 3.09 Å. En considérant
l’environnement, l’oxygène O2 est stabilisé par le résidu Hip 245 et par une molécule
d’eau.
Dans le document
Etude QM/MM de systèmes bioluminescents
(Page 178-181)