Culture cellulaire

1.1 Mise en place des cultures primaires de chondrocytes humains

1.1.1 Origine des prélèvements humains

Les fragments de cartilage arthrosique sont obtenus à partir de patients atteints d’arthrose

qui ont subi une arthroplastie totale du genou dans le service de Chirurgie Orthopédique et

Traumatologique de l'Hôpital Central de Nancy (CHRU, Nancy, Pr. Didier Mainard). Ils sont

classés comme grades 3 et 4 selon le classement d’arthrose de Kellgren et Lawrence. En

parallèle, de nombreuses données relatives aux patients collectées dans le dossier médical ont

été recueillies après autorisation des services concernés, en particulier en rapport avec notre

étude, l’âge, le poids, et la consommation tabagique. L'étude a été approuvée par notre institut

de recherche local (Commission de la Recherche Clinique, UF 9757-CCRP 2004-Cellules

Souches et chondrogénèse) et est conforme aux directives éthiques de la Déclaration

d'Helsinki.

1.1.2 Mise en culture des chondrocytes arthrosiques humains

Les cartilages sont séparés des tissus osseux et conjonctifs sous-jacents. Ensuite, les

tranches du cartilage articulaire sont isolées avec 2 mg/ml de pronase (Sigma-Aldrich)

pendant 90 min à 37°C. La solution de pronase est alors remplacée par 1,5 mg/ml de

collagénase (Roche) dans DMEM/F12 (Gibco) sans sérum pendant une nuit à 37°C. Le

surnageant est recueilli et centrifugé à 300 g pendant 5 min. Le culot cellulaire obtenu est mis

en suspension dans DMEM/F12 avec 1% de pénicilline/streptomycine, 2 mM de L-glutamine,

100 μM Proline, 200 μM 2-phospho-L-acide ascorbique (Sigma-Aldrich) contenant 15% (v/v)

de sérum de veau fœtal dé-complémenté (SVF, Dutscher). Un comptage cellulaire est réalisé:

10 μl de cette suspension cellulaire et 10 μl de Bleu Trypan sont additionnés sur une cellule

de comptage (compteur automatique de cellules TC20, Bio-Rad). Une fois le comptage

effectué, les cellules sont ensemencées en fioles de 75 cm² (Corning Incorporated) à une

densité de 2×10

4

cellules/cm

2

avec 15 mL de milieu de culture : passage 0 (P0), et incubées

dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO

2

en normoxie (20% O

2

) ou hypoxie (2% O

2

) à

37°C jusqu'à confluence. Le milieu de culture est changé tous les deux jours. Nous avons

utilisé des chondrocytes au passage (P) P0 afin de limiter la dédifférenciation de ce type

cellulaire.

1.2 Mise en place des cultures des CSM-GW

1.2.1 Origine des prélèvements humains

Les CSM-GW sont fournies par l’Unité de Thérapie Cellulaire et Banque de Tissus

(UTCT, CHRU, Nancy, Pr. Danièle Bensoussan). Les cellules sont prélevées à partir du

cordon ombilical de nouveaux-nés après en avoir informé la mère et avoir obtenu son

consentement. Les cordons conservés à 4°C sont isolées par diffusion et adhésion sur

plastique (par la méthode des explants), puis les cellules sont conservées dans de l’azote

liquide à la fin du P0 en présence de DMSO. Chaque cordon est identifié par un numéro de

façon à établir une traçabilité des prélèvements. Pour chaque cordon des informations sur la

mère sont obtenues.

1.2.2 Analyse de l’expression de marqueur de surface cellulaire

suspension dans la solution de blocage, sont réparties à raison de 1×10

5

cellules par tube.

Après 20 min d’incubation, elles sont lavées par centrifugation (300 g, 5 min) et les culots

cellulaires sont repris dans 100 μL de solution d’immunomarquage incluant soit différents

anticorps, soit IgG-PE/FITC (contrôle iso-typique) ou dans 100 μL de la solution de blocage

(contrôle négatif). A l’issue d’une incubation pendant 30 min à température ambiante et à

l’abri de la lumière, 0,5 mL de DMEM sans rouge de phénol sont ajoutés dans chaque tube,

puis une centrifugation (300 g, 5 min) est faite afin d’éliminer les anticorps en excès. Le culot

cellulaire est alors repris dans 300 μL de DMEM sans rouge de phénol avant d’être analysé en

cytométrie en flux (Gallios, Beckman Coulter). Les principaux antigènes de surface cellulaire

CD34, CD45, HLA-DR, CD44, CD73, CD90, et CD105 sont détectés pour chaque

échantillon (Tableau 4). Les cellules utilisées dans notre étude sont négatives pour les

marqueurs hématopoïétiques (CD45, CD34, HLA-DR) et positives pour les marqueurs

mésenchymateux (CD90, CD73, CD105) (Dominici et al., 2006).

Tableau 4 Les anticorps impliqués pour les immunomarquages de CSM-GW

Anticorps Spécificité de l’espèce Isotype Fournisseur

Anti-CD34/PE Humain IgG (Souris) BD Pharmingen

Anti-CD45/FITC Humain IgG (Souris) DakoCytomation

Anti-CD73/PE Humain IgG (Souris) BD Pharmingen

Anti-CD90/FITC Humain IgG (Souris) Beckman Coulter

Anti-CD105/PE Humain IgG (Souris) Beckman Coulter

Anti-CD44/FITC Humain IgG (Souris) Beckman Coulter

HLA-DR/FITC Humain IgG (Souris) Beckman Coulter

Contrôle isotypique/PE Humain IgG (Souris) Dako

1.2.3 Mise en culture des CSM-GW

La suspension cellulaire, conservée dans de l’azote liquide est progressivement chauffée

dans un bain-marie à 37°C jusqu’à la fonte totale du contenu du cryotube. Les cellules sont

ensuite lavées avec du milieu complet pour éliminer le DMSO. Enfin, les CSM-GW sont

ensemencées en fioles de 75 cm² (Corning Incorporated). Les cellules sont cultivées dans

αMEM (Lonza) contenant 1% de pénicilline/streptomycine, 2 mM L-glutamine, et 10% (v/v)

de SVF dé-complémenté. L’ensemencement s’effectue à une densité de 5×10

3

cellules/cm

2

.

Les cellules sont cultivées à 37°C en hypoxie (2% O

2

), le milieu de culture est changé tous les

deux jours.

1.2.4 Passage et congélation

Les cellules se multiplient et sont transférées dans de nouvelles fioles une fois à

sub-confluence. Pour chaque passage, les cellules sont rincées avec du PBS (Gibco). 3 mL de

trypsine (Gibco) sont ajoutés dans fiole de 75cm² et laissés en contact des cellules pendant 5

min à 37°C. La réaction enzymatique est arrêtée par addition d’un volume égal du milieu

complet. La solution contenant les cellules est centrifugée (300 g, 5 min). Le culot cellulaire

est repris dans du milieu complet et une numération cellulaire est effectuée avec la même

méthode que celle utilisée pour les chondrocytes. Les CSM-GW sont répartis dans des fioles

ou sur des plaques de culture à la densité désirée. Les cellules sont utilisées jusqu'au P5.

Pour la congélation des cellules, le culot cellulaire, obtenu après l’action de la trypsine,

est repris par une solution de SVF contenant 10% de DMSO à 4°C, de façon à obtenir 1×10

6

cellules/mL de milieu de congélation. La suspension cellulaire est enfin conservée dans un

congélateur à -80°C pendant 24h puis stockée à plus long terme à -145°C.

Dans le document La consommation tabagique comme facteur de risque environnemental de l’arthrose : rôle de la nicotine dans la prolifération et la différenciation chondrogénique des cellules souches mésenchymateuses humaines (Page 95-99)