2.6 Oscillateurs mutuellement couplés
3.1.1 Croissance et cultures cellulaires
3.1
3.1
3.1 Dispositifs expérimentauxDispositifs expérimentauxDispositifs expérimentauxDispositifs expérimentaux
3.1.1
3.1.1
3.1.1
3.1.1 Croissance et cultures cellulairesCroissance et cultures cellulairesCroissance et cultures cellulairesCroissance et cultures cellulaires
Souches bactériennes Souches bactériennes Souches bactériennes Souches bactériennes
La cyanobactérie Synechoccocus sp. strain PCC 7942, que nous avons choisie pour notre étude est l’un des organismes les plus simples présentant un comportement circadien [21]. L’utilisation du rapporteur de la luciférase est une méthode qui permet, depuis plus de 10 ans, de suivre l’expression génétique circadienne de populations de cyanobactéries [21, 27]. Le terme « rapporteur » désigne ici des insertions sur deux sites neutres du chromosome de la cyanobactérie des gènes luxAB et luxCDE, auxquels sont associés des promoteurs de la cyanobactérie. L’émission de lumière (spectre centré sur 490 nm), est le résultat d’une réaction
CHAPITRE 3. CARACTÉRISATION DE LA BIOLUMINESCENCE DES CYANOBACTÉRIES
66
biochimique catalysée par l’hétérodimère LuxAB, utilisant comme substrat un aldéhyde produit et recyclé par le complexe LuxCDE.
Les deux souches bactériennes luminescentes que nous utilisons pour nos études sont AMC 462 et AMC 412, dont les caractéristiques sont les suivantes [77] :
Rappelons que la notation PkaiBC::luxAB fait référence aux gènes luxAB insérés devant le promoteur du gène kaiBC. Les inserts cités dans la table précédente sont, de plus, fusionnés à des gènes résistants à un antibiotique choisi : les insertions sur le site neutre I comportent un gène résistant à la spectinomycine ; et les insertions sur le site neutre II comportent un gène résistant au chloramphénicol.
Pour les 2 souches choisies, les gènes luxCDE sont sous le contrôle du PpsbAI, qui est le plus fort promoteur de la cyanobactérie. Ceci assure que le substrat (l’aldéhyde) est présent en quantité non limitante pour entretenir la réaction.
Une grande partie de notre étude a été centrée sur la souche AMC 462, puisqu’elle donne accès directement à l’expression du gène clé de l’horloge circadienne kaiC (cf. 1.2). Par ailleurs, la souche AMC 412 présente l’avantage d’être la plus fortement luminescente de toutes les souches munies du rapporteur de la luciférase [35] puisque le gène luxAB est inséré derrière le promoteur du gène psbAI. Nous verrons que cette souche est suffisamment luminescente (émission de
∼
20 photons/minute/bactérie) pour permettre de suivre les oscillations circadiennes de cellules individuelles.Il faut noter enfin que l’utilisation de la GFP (green fluorescent protein) ou d’autres protéines fluorescentes est moins adaptée à l’étude des cyanobactéries, essentiellement parce que ces dernières sont elles-mêmes fortement fluorescentes sous irradiation lumineuse (FIG. 3-1). Par ailleurs, le métabolisme et l’horloge circadienne sont susceptibles d’être affectés par la forte intensité de lumière nécessaire à l’excitation de la protéine [78]. Enfin, la GFP peut être sujette au photoblanchiment, à cause d’une exposition prolongée à la lumière nécessaire à la croissance cellulaire.
Souche Insertion sur le site neutre I Insertion sur le site neutre II
AMC 462
PkaiBC::luxAB
PpsbAI::luxCDE
3.1 DISPOSITIFS EXPÉRIMENTAUX 67
Croissan Croissan Croissan Croissancecece ce
La contamination est un phénomène indésirable, mais courant, lors des manipulations d’organismes vivants en biologie. Ce terme désigne ici l’invasion des cultures cellulaires étudiées par des microorganismes vivants étrangers. C’est pourquoi, afin d’éviter toute forme de contamination inopinée, nous manipulons les cultures cellulaires sous une hotte à flux laminaire. Les souches peuvent être cultivées dans leur milieu de culture solide ou liquide. La seule différence entre les deux milieux étant l’ajout d’un gélifiant, l’agar, pour le milieu solide. La composition chimique du milieu de culture (FIG. 3-2) est prévue pour apporter aux cellules tous les nutriments nécessaires à leur croissance (hormis le CO2 et le O2 indispensables à la respiration et la photosynthèse).
Les cultures en milieu solide sont réalisées dans des boîtes de Pétri, les cellules étant étalées à la surface du milieu avec des pointes en plastique stériles. La boîte de Pétri est ensuite fermée par son couvercle puis scellée avec un film de paraffine pour prévenir toute forme de contamination et d’évaporation.
Puis les cellules ainsi cultivées sont mises à croître en milieu liquide dans des fioles fermées par du papier d’aluminium (FIG. 3-3). Par la suite, nous avons été amenés à mélanger des souches sauvages, et des souches possédant le rapporteur de la luciférase, c’est pourquoi nous réalisons nos cultures liquides en l’absence d’antibiotiques, afin de ne pas détruire les souches qui ne possèdent pas les gènes résistant aux antibiotiques lors de ces mélanges. Les
a b
a b
FIG. FIG. FIG.FIG. 3333----1111 Images de FRAP (redistribution de fluorescence après photoblanchiment) de la cyanobactérie Images de FRAP (redistribution de fluorescence après photoblanchiment) de la cyanobactérie Images de FRAP (redistribution de fluorescence après photoblanchiment) de la cyanobactérie Images de FRAP (redistribution de fluorescence après photoblanchiment) de la cyanobactérie
Synechoccocus sp. strain PCC 7942 Synechoccocus sp. strain PCC 7942 Synechoccocus sp. strain PCC 7942
Synechoccocus sp. strain PCC 7942. a)a)a) Les phycobilisomes sont excités à 633 nm. Après le photoblanchiment a)
on observe la diffusion des phycobilisomes dans la bactérie. b)b)b)b) La chlorophylle est excitée à 442 nm, et a une
faible mobilité dans la cellule.
CHAPITRE 3. CARACTÉRISATION DE LA BIOLUMINESCENCE DES CYANOBACTÉRIES
68
inserts étant petits, et situés directement sur le chromosome, la bactérie n’a qu’un faible risque de les perdre au cours des divisions cellulaires.
3 2 4 2 4 2 2 3 NaNO K HPO ,3H O MgSO ,7H O
Citrate ferrique d'ammonium EDTA
Na CO Oligo-éléments Eau désionnisée Agar (si milieu solide) spectinomycine (si nécessaire) chloramphénicol (si nécessaire)
1.5 g 0.04 g 0.075 g 0.012 g 0.001 g 0.02g 1 ml 1 litre 10.0 g 5 mg 7.5 mg 3 3 2 2 4 2 4 2 4 2 2 3 2 2 H BO MnCl ,4H O ZnSO ,7H O NaMoO ,5H O Cu(SO ) ,5H O Co(NO ) ,6H O Eau désionisée Oligo - éléments 2.86 g 1.81 g 0.222 g 0.39 g 0.079 g 49.4 mg 1.0 litre FIG. FIG. FIG.
FIG. 3333----2222 Composition chimique du milieu de culture u Composition chimique du milieu de culture u Composition chimique du milieu de culture u Composition chimique du milieu de culture utilisée pour les cyanobactériestilisée pour les cyanobactériestilisée pour les cyanobactéries tilisée pour les cyanobactéries
FIG.
FIG. FIG.
FIG. 3333----3333 Cultures cellulaires liquide (à gauche), et sur boîte de Pétri (à droite). Cultures cellulaires liquide (à gauche), et sur boîte de Pétri (à droite). Cultures cellulaires liquide (à gauche), et sur boîte de Pétri (à droite). Cultures cellulaires liquide (à gauche), et sur boîte de Pétri (à droite). Les cyanobactéries sont
3.1 DISPOSITIFS EXPÉRIMENTAUX 69
Les cultures sont conservées dans un incubateur, qui est une enceinte isolée de l’environnement externe, optimisée pour permettre la croissance cellulaire, grâce à un contrôle externe de la température, de la lumière et du taux de CO2 dans l’enceinte. Ainsi, en dehors des périodes d’entraînement, les cultures sont exposées à une lumière blanche constante de 900 lux, à 30°C, et sous un taux de CO2 de 1400 ppm. Pour les expériences nécessitant des cultures cellulaires entraînées, nous programmons l’incubateur pour qu’il règne dans l’enceinte des conditions périodiques de lumière : les cellules sont ainsi soumises à un cycle de période 24h constitué de 12 heures de « jour » (à 900 lux), suivi de 12 heures d’obscurité complète, la température et le taux de CO2 étant identiques à ceux sans entraînement.
Les fioles contenant les cultures liquides sont disposées sur une plate-forme rotative, assurant ainsi l’homogénéisation des conditions de croissance (contact avec le milieu, lumière reçue...) de toutes les cellules d’une fiole. Cette enceinte permet ainsi d’assurer, d’une part une croissance cellulaire optimale, et d’autre part un entraînement de toutes les cultures présentes dans l’incubateur à la même phase.
Congélation Congélation Congélation Congélation
Enfin, il nous est possible de conserver à long terme des cultures cellulaires liquides grâce à la congélation : pour ce faire, des cultures liquides sont introduites dans des cryotubes de 2 mL avec 150 µl⋅ml-1 de glycérol. Le glycérol joue le rôle d’antigel, et permet ainsi d’éviter la formation de cristaux de glace à l’intérieur des cellules. Ce mélange cellules+glycérol est alors conservé dans un congélateur, à une température de -80°C. Par la suite, en cas de besoin, ces cellules sont décongelées, puis diluées environ 5 fois dans du milieu de culture avant d’être mises à croître dans l’incubateur. L’ajout de milieu permet ainsi de diluer le glycérol, et de favoriser la croissance cellulaire. En effet, suite à la décongélation, les cellules n’entrent pas en phase de croissance immédiatement : elles ont une période de «latence» de quelques heures. On ne peut utiliser ces cellules pour nos expériences qu’après un bref séjour dans l’incubateur. Comme les expériences en population sont réalisées avec des cultures de densité optique initiale
750nm 0.1
DO ≈ (3.1.3), nous nous assurons que les cultures congelées ont une concentration
750nm 0.5
DO > (DO750nm ≈ −1 2), afin de garantir après dilution, une concentration cellulaireDO750nm ≈0.1.