2.6 Oscillateurs mutuellement couplés
3.1.3 Acquisition de la bioluminescence d’une population d’oscillateurs
3.1.3
3.1.3
3.1.3 Acquisition de la bioluminescence d’une population d’oscillateursAcquisition de la bioluminescence d’une population d’oscillateursAcquisition de la bioluminescence d’une population d’oscillateursAcquisition de la bioluminescence d’une population d’oscillateurs
Le suivi de la bioluminescence d’une population de cyanobactéries est effectué grâce à un compteur de luminescence pour microplaques de 96 puits Packard TopCount NXT. Ce compteur est constitué de 3 parties principales (FIG. 3-7a) : i) le module comprenant les 2 photomultiplicateurs, permettant ainsi le comptage de 2 puits simultanément ; ii) un ordinateur permettant de contrôler les options de comptage, et de faire l’acquisition du nombre de photons comptés en temps réel ; iii) la zone de chargement des microplaques.
La chambre de croissance La chambre de croissance La chambre de croissance La chambre de croissance
Nous avons installé autour de la zone de chargement des microplaques, une boîte isolée thermiquement par de la mousse, afin de créer une chambre de croissance appropriée aux cellules contenues dans les microplaques. La température de cette chambre est fixée à 30°C grâce à une régulation thermique à base de modules à effet Peltier. Nous contrôlons également le taux de CO2 dans la chambre. Enfin, la chambre est placée sous lumière artificielle blanche, assurant ainsi aux cellules une intensité lumineuse de 900 lux. Tous les paramètres de température, CO2, et intensité lumineuse sont contrôlés et constants, afin d’éviter toute éventualité d’entraînement par des variations circadiennes de l’environnement externe.
Les microplaques Les microplaques Les microplaques Les microplaques
Il existe différents types de microplaques permettant le comptage de la bioluminescence. Celles que nous choisissons pour nos mesures sont blanches, ce qui limite l’absorption par les plaques des photons provenant de la bioluminescence. Les plaques sont composées de 96 puits identiques, de 1 cm de profondeur, et de volume 300 µl.
La lecture de la bioluminescence est effectuée par un couple de photomultiplicateurs se plaçant au dessus des puits, la cellule photosensible ayant une forme circulaire de même
CHAPITRE 3. CARACTÉRISATION DE LA BIOLUMINESCENCE DES CYANOBACTÉRIES
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dimension que celle des puits. Il se peut que lors du comptage des photons d’un puits donné, les photons provenant des puits adjacents soient aussi détectés par le photomultiplicateur ; on parle alors de « cross-talk ».
Les microplaques choisies permettent de limiter ce phénomène, grâce à un écart suffisant entre deux puits voisins. En outre, lorsque sur une même plaque, se trouvent des cultures émettant des intensités de bioluminescence d’ordres de grandeurs différents, nous séparons les puits contenant les cultures par des puits vides. La FIG. 3-7b montre un exemple de plaque dont les 16 puits de gauche contiennent des cultures fortement luminescentes. Les 8 puits vides assurent que pour le reste de la plaque (contenant des souches émettant ici 20 fois moins de photons), et en particulier pour la 4ème colonne de gauche, les photons détectés par les photomultiplicateurs ne proviennent pas des cultures fortement luminescentes voisines.
Prépar Prépar Prépar
Préparation des échantillons ation des échantillons ation des échantillons ation des échantillons
Les puits de chaque microplaque sont emplis de 250 µl de cellules, à une
750nm 0.1
DO = , soit environ 3.107 cellules/puits (ce choix de DO est justifiée 3.2.2). La chambre de croissance dans laquelle les plaques séjournent n’est pas stérile, et nous devons par conséquent recouvrir les puits afin de réduire les risques de contamination. La présence de lumière, de CO2 et de O2 étant indispensable à la bonne croissance cellulaire, nous les scellons à l’aide d’un film adhésif plastique transparent, perforé manuellement au dessus de chaque puits à l’aide d’un bistouri stérile. Il existe des films transparents perméables aux gaz, mais une expérience nous a montré que, avec ce type de film, l’apport en gaz n’était pas suffisant, puisque les cellules ont péri après seulement quelques jours en plaques.
Acquisition de la bioluminescence Acquisition de la bioluminescence Acquisition de la bioluminescence Acquisition de la bioluminescence
Toutes les 30 minutes environ, la plaque est automatiquement transférée dans la chambre noire contenant les photomultiplicateurs ; puis un délai de 2 minutes est programmé avant que sa luminescence ne soit lue par les photomultiplicateurs. Ce délai permet d’éviter que les photons parasites - dus à la phosphorescence et aux chromophores cellulaires - soient pris en compte. Chaque photomultiplicateur lit au total la moitié de la plaque (48 puits), durant 5 sec/puits, ce qui fait un total de 4 minutes/plaque. Les perturbations que subissent les cellules dans la plaque ont donc une durée de l’ordre de 7 minutes ; cette durée est minime comparée à la période d’oscillation des cellules (
∼
24 h), ce qui nous assure que cette méthode d’acquisition de la bioluminescence n’influe pas sur la phase de l’oscillation circadienne des cyanobactéries. Le bruit de fond du comptage des photons est estimé en mesurant la bioluminescence de puits ne contenant que du milieu de culture ; on l’estime à environ 173 coups par tranche de 5 secondes de comptage. Par la suite, toutes les courbes de bioluminescence seront présentées avec cette valeur de bruit de fond déjà soustraite (FIG. 3-8).3.1 DISPOSITIFS EXPÉRIMENTAUX 75 FIG. FIG. FIG.
FIG. 3333----7777 Dispositif expérimental permettant le suivi de la bioluminescence en population. a) Dispositif expérimental permettant le suivi de la bioluminescence en population. a) Dispositif expérimental permettant le suivi de la bioluminescence en population. a) La zone Dispositif expérimental permettant le suivi de la bioluminescence en population. a)
de chargement des plaques, est située au 1er plan. Le module comportant les 2 photomultiplicateurs se trouve
au second plan. Une chambre de croissance (boîte entourant la zone de chargement) complète ce dispositif ; elle est constituée d’une boîte permettant d’isoler de l’environnement extérieur les plaques stockées dans la zone de chargement. Afin d’assurer une croissance optimale des cellules des plaques, en évitant tout
entraînement indésirable, nous régulons la lumière, la température et le taux de CO2 dans la chambre afin
que tous ces paramètres soient constants (resp. 900 lux, 30°C, 1400 ppm) b)b)b) 250 microlitres de culture sont b)
disposés dans chacun des 96 puits constituant la microplaque. La plaque est alors installée dans la zone de chargement ; le passage dans la chambre contenant les photomultiplicateurs est automatisé. Les photons sont comptés pendant 5 secondes/puits. Quand la lecture de la plaque est achevée, celle-ci est renvoyée dans la zone de chargement. La bioluminescence est comptée toutes les 30 minutes. Les pointillés rouges montrent l’organisation spatiale de la plaque. Au sein de chacun des groupes délimités par les pointillés, les puits contiennent des cultures cellulaires strictement identiques (en terme de concentration, d’entraînement, de choix de la souche…). Sur une même plaque, il est donc possible de réaliser 8 à 10 séries de mesures
différentes. Sur cette plaque, la 3ème colonne de droite est vide, et permet d’éviter le « crosstalk », entre les
puits contenant des cultures fortement luminescentes (colonne désignée par une flèche pleine), et les puits faiblement émetteurs de photons (flèche pointillées).
CHAPITRE 3. CARACTÉRISATION DE LA BIOLUMINESCENCE DES CYANOBACTÉRIES 76 Limites du protocole Limites du protocole Limites du protocole Limites du protocole
Nous verrons 4.1.3 que pour des expériences longues (supérieures à une dizaine de jours), nous sommes amenés à compenser l’évaporation du milieu en ajoutant du milieu « frais » dans les puits une fois par semaine. Quand le milieu cellulaire est en partie évaporé dans les puits, nous sortons les plaques de leur chambre de croissance, et après avoir ôté le film plastique les recouvrant, complétons les puits à 250 µl avec du milieu de culture à 30°C. La fin de la préparation est identique à celle expliquée en 3.1.3. les plaques sont scellées, puis le film transparent perforé avant de remettre ces plaques dans leur chambre de croissance. L’ajout du milieu est un procédé qui nécessite une minutie particulière afin de ne pas « casser » le dépôt cellulaire formé dans le fond du puits, et ainsi éviter toute perturbation éventuelle de rythme circadien des cellules.
Nous avons vu que cette technique permet de réaliser sur une même plaque, plusieurs conditions expérimentales. Ainsi, au cours d’une même expérience, nous pouvons suivre par exemple la bioluminescence de cultures entraînées à des phases différentes, ou encore de cultures contenant des mélanges de souches, etc. Mais nous veillons toutefois à conserver initialement 8 à 16 puits par type de condition expérimentale, pour s’assurer de la bonne reproductibilité de nos mesures. Pour une même condition expérimentale, toutes les précautions sont prises pour réaliser des puits strictement identiques. La culture liquide est agitée pour l’homogénéiser avant l’introduction dans chacun des puits ; nous perforons le film plastique au dessus de chaque puits
0 2 4 6 8 10 12 14 102 103 104 105 B io lu m in e s c e n c e /p u it s ( c ts ) Temps (Jours) FIG. FIG. FIG.
FIG. 3333----8888 Oscillations de bioluminescence Oscillations de bioluminescence Oscillations de bioluminescence Oscillations de bioluminescence d’un puits contenant 250 µl d’une culture de AMC 462
3.1 DISPOSITIFS EXPÉRIMENTAUX 77
aussi régulièrement que possible. Cependant, les puits n’ont pas nécessairement une évolution strictement identique pour autant. En effet, ils ne sont pas à l’abri d’une contamination, et la taille des fentes, n’est pas exactement la même pour chacun des puits, ce qui peut engendrer une évaporation plus ou moins rapide du milieu cellulaire, ou une aération insuffisante des cultures. Nous sommes alors souvent amenés à exclure certains puits d’une même condition lors de notre analyse (cf. 3.3.1).