Criblage des mutations par le test de l’endonucléase T7E1 et PCR

Un échantillonnage d’embryons à 24hpf est digéré en protéinase K pour extraire l’ADN. Une PCR en utilisant des amorces flanquant le site de reconnaissance de l’ARNg est réalisée avec les amorces suivantes : 5’-TGT GGC TCT TTT TAG ATT CTC GG-3’ et 5’-ACC AGC ATT ATG GCT GTG TCA-3’ (ARNg 1 et 2), AGC GGA GCG GGT AAT AAA GG-3’ et 5’-CAG ACA GAC AAC AGA CAC TGG T-3’ (ARNg 3), 5’-ACC AGT GTC TGT TGT CTG TCT-3’ et 5’-AGC TAA ACT TAG ACC ACG TCC AT-3’ (ARNg 4). Les produits de PCR sont ensuite purifiés sur colonnes QIAquick (QIAGEN). Une moitié de l’ADN purifié est alors dénaturé dans le tampon de l’enzyme (1X) suivant le programme : 5 min à 95 °C, de 95°C à 85°C à −2 °C/s, de 85°C à 25°C à −0.1 °C/s, puis à 4 °C (Reyon et al. 2012). L’ADN réhybridé est digéré par l’endonuclease T7E1 (New England Biolabs) à 37°C pendant 30min avant d’être déposé sur gel d’agarose 2% avec l’autre moitié du produit de PCR non digéré. Le criblage des délétions est fait par PCR en utilisant les amorces de chaque côté de l’élément, ici : 5’-TGT GGC TCT TTT TAG ATT CTC GG-3’ (amorce sens pour ARNg 1 et 2) et 5’-AGC TAA ACT TAG ACC ACG TCC AT-3’ (amorce antisens pour ARNg 4).

2.3 Résultats

J’ai préparé deux ARNg ciblant en amont de l’élément C et deux autres en aval (fig. 17B) pour réaliser la délétion de cet élément cis-régulateur du gène krox20 appelé egr2b chez le poisson-zèbre. La capacité de coupure de la protéine Cas9, après injection avec les différents ARNg, a été contrôlée par le test de l’endonuclease T7. L’ADN génomique à proximité du site putatif de ciblage de l’ARNg est amplifié par PCR, puis le produit est déshybridé et réhybridé afin d’obtenir des hétéroduplexes. Ces derniers comportent des mésappariements reconnus par l’endonuclease T7 qui coupe l’ADN simple brin. Ces tests ont permis de déterminer que l’ARNg 2 et l’ARNg 4 sont efficaces pour couper en amont et en aval de l’élément C respectivement (fig. 17C). La co-injection de ces deux ARNg et de l’ARNm de la Cas9 permet d’obtenir la délétion mosaïque de l’élément C dans environ 15% des poissons de première génération ou F0 (fig. 17D). Les F0 sont ensuite croisés avec des poissons sauvages pour obtenir des hétérozygotes pour la délétion de l’élément C en F1. La transmission de la délétion en F1 est plus rare et nous avons obtenu deux fondateurs sur plus

d’une trentaine de poissons. Le croisement des F1 permet l’obtention d’embryons homozygotes pour la délétion et le phénotype sur l’expression de krox20 est analysé par hybridation in situ contre krox20. La délétion de l’élément n’engendre pas de modifications de l’expression du gène krox20 que ce soit pendant l’initiation autour de 6 somites ou lors de l’autorégulation à 12 somites (fig. 17E). L’élément C de poisson n’est donc pas le seul élément cis-régulateur actif dans r3 pendant l’initiation du gène Krox20 comme nous l’avons montré chez la souris (cf Chapitre 2). De plus il ne semble pas jouer de rôle pendant l’autorégulation contrairement à ce qui est observé chez la souris. Cette absence de fonction de C pendant l’autorégulation de krox20 chez le poisson ne m’a donc pas permis d’utiliser ce modèle pour décrypter les mécanismes mis en œuvre dans la coopération entre élément A et C uniquement observée dans l’embryon de souris.

2.4 Conclusions et perspectives

L’absence de phénotype pour la délétion de l’élément C chez le poisson pourrait s’expliquer par une activité différente de l’élément C poisson par rapport à l’élément C poulet ou souris notamment à cause de la partie non conservé de l’élément. Cependant, les expériences de transgénèse réalisées chez le poisson-zèbre ne permettent pas de mettre en évidence une différence d’activité. Les deux éléments n’ont pas gardé la même fonction in

vivo au locus Krox20 malgré une activité similaire par transgénèse. Ceci pourrait s’expliquer par la distance entre le promoteur et l’élément A qui est de 217 kb chez la souris et seulement de 74 kb chez le poisson. Il est possible d’imaginer que cette différence soit à l’origine d’une conformation différente du locus qui ferait de l’élément C une plateforme pour le rapprochement de l’élément A du promoteur pendant la phase d’autorégulation chez la souris. Une distance plus faible ne nécessiterait pas l’aide de l’élément C pour l’autorégulation chez le poisson. Il y aurait ainsi une utilisation différente d’éléments cis-régulateurs conservés en séquence pour l’expression d’un gène de développement au cours de l’évolution en réponse à la complexification des génomes. Une autre hypothèse serait que d’autres redondances d’éléments cis-régulateurs chez le poisson compenseraient aussi le phénotype d’autorégulation observé chez la souris. Ce travail a été repris par un étudiant en thèse qui mène une analyse systématique d’identification des enhancers du gène krox20 par transgénèse et des délétions, parfois combinées, de ces éléments cis-régulateurs dans le génome du poisson afin de proposer un modèle de régulation d’un gène de développement le plus complet possible.

Le gène Krox20 est un gène clef dans le développement du rhombencéphale. L’expression de ce gène suit deux phases : une phase de démarrage dirigée par des éléments initiateurs fonctionnant indépendamment de la protéine KROX20 et une phase d’autorégulation qui requiert la présence de la protéine. Pour analyser la contribution des éléments cis-régulateurs identifiés dans le rhombencéphale dans la régulation du gène Krox20, j’ai effectué une analyse fonctionnelle de ces éléments. Dans un premier temps, la délétion de l’élément A a permis de montrer son rôle direct dans l’autorégulation du gène Krox20. Dans un deuxième temps, la délétion de l’élément C a révélé son rôle non pas au cours de l’initiation comme on l’attendait, mais pendant l’autorégulation en coopération en cis avec l’élément A grâce à des approches de génétiques et génomiques. Dans un dernier temps, j’ai démontré que l’élément C n’a pas le même rôle chez le poisson-zèbre pour la régulation du gène Krox20. Je discuterai dans cette partie des conséquences des délétions de ces deux enhancers chez la souris, puis chez le poisson-zèbre ; délétions qui ont révélé que d’autres éléments restaient à identifier pour expliquer la régulation du gène Krox20 dans le rhombencéphale. Je détaillerai les candidats récemment identifiés notamment grâce aux données d’accessibilité de la chromatine et de conservation de séquence. Je finirai par discuter des limitations de notre système d’étude et des technologies qui permettront prochainement d’analyser finement la régulation des gènes.