Courbes de croissance

La comparaison des courbes de croissances de diverses souches suite à l’irradiation aux UV permet de détecter des souches de levure présentant un phénotype de sensibilité aux rayons ultraviolets. Cette technique, développée dans notre laboratoire (Toussaint et al., 2006 ; Toussaint et Conconi, 2006), est rapide à effectuer et très sensible.

Le jour précédant l’expérience, les souches d’intérêts ont été inoculées dans 10 ml de bouillon YeP + 2% glucose et incubées à 30°C durant la nuit afin d’obtenir des cultures en phase exponentielle de croissance le lendemain. Les cellules ont été transférées dans un tube conique de 15 ml avant d’être centrifugées à 3200x g pour une minute afin de retirer le milieu de culture (qui absorbe les rayonnements ultraviolets et fausse donc les expérimentations). À ce culot, 10 ml d’eau stérile a été ajouté, le culot a été resuspendu et une centrifugation a été répétée pour ensuite retirer le surnageant. Le culot a été resuspendu dans 5 ml d’eau stérile, la densité optique des cultures a été mesurée à 660nm et les cellules ont été diluées à une concentration de 0,8 X 107 _{cellules/ml dans de l’eau stérile.}

De ces cultures diluées, un volume de 350 µl a été placé sur une plaque de verre autoclavée, où des cercles de cire ont préalablement été tracés afin de contenir le liquide en une goutte. Avant l’exposition aux rayons UV, 5 µl en triplicata ont été prélevés et resuspendus dans une plaque de 96 puits contenant 95 µl de milieu YeP + 2% glucose. Par la suite, une irradiation de 50 J/m2_{, calculée grâce à l’utilisation d’un radiomètre digital UVX équipé d’un détecteur}

à UVc (détecteur UVX-25 - UVP Inc.), a été effectuée et le prélèvement de 5 µl en triplicata a été répété. Deux irradiations additionnelles de 50 J/m2 _{ont été effectuées, pour l’obtention}

de courbes de croissance à des conditions finales d’irradiation de 0, 50, 100 et 150 J/m2_{. La}

plaque de 96 puits a été transférée dans un lecteur de plaque à 30°C avec vibration (Modèle PowerWave XS de Bio-Tek) pour une lecture de la densité optique à 660 nm aux 10 min pendant 48h. Suite à cette incubation, les données sont transférées dans le logiciel Excel pour analyse et création des courbes de croissance.

2.4. Induction des lésions par les rayonnements UV et collecte des points de réparation

La souche d’intérêt est inoculée dans deux fois 500 ml de milieu YePD et incubée toute la nuit à 30°C. Le lendemain, lorsque la densité optique à 660 nm de la culture est de 0,4, soit 1,2 x 107 _{cellules/ml. Les cellules sont resuspendues dans un volume final de 300 ml de PBS}

gardé sur glace (Phosphate Buffered Saline - 125 mM NaCl, 3 mM KC1, 10 mM Na2HPO4-

7H20, pH 7,0). Pour cela, les cellules sont culotées dans 8 tubes coniques de 50 ml. Les tubes

sont remplis avec de 50 ml de culture et centrifugé à 3200x g pour 1,25 min (centrifugeuse Centra CL3 équipée d’un rotor #243. Thermo Fisher Scientific). Le surnageant est éliminé et les tubes sont remplis de nouveau avec la culture puis centrifugés, tel que précédemment, et ce jusqu’à ce que toute la culture ait été centrifugée. Après la dernière série de centrifugation, les dernières gouttes de YePD sont absorbées avec papier absorbant, le mileu de culture absorbant les rayons UVs. Les culots cellulaires sont ensuite resuspendus dans 35 ml de PBS froid puis transférés dans un erlenmeyer de 500 ml maintenant dans la glace. 20 ml de PBS froid sont utilisés pour rincer les 8 tubes et sont ajoutés aux 280 ml de suspension de levures gardée dans la glace afin d’obtenir un volume final de 300 ml de suspension de levures contenant 4 x 107 _{cellules/ml. Un aliquote de 45 ml est transféré dans un tube conique de 50}

ml maintenu dans la glace : celui-ci est considéré l’échantillon non irradié (-UV). À partir de ce point, il est critique d’éviter toute lumière, au-delà de celle émise par des néons fluorescents jaunes (Phillips) afin d’éviter l’activation de la CPD photolyase, présente chez S. cerevisiae. Le volume restant, soit environ 250 ml, est transféré dans un bac où l’épaisseur maximale de la suspension de levures est de 2 mm. Ce bac est installé dans une hotte à PCR (C.B.S. Scientific Co) contenant des néons germicides émettant des UVC, à un pic de 254 nm. Les levures sont irradiées à une dose de 180 J/m2_{, calculée grâce à l’utilisation d’un}

radiomètre digital UVX équipé d’un détecteur à UVC (détecteur UVX-25 - UVP Inc.). Les levures irradiées sont transférées dans un second erlenmeyer, conservé sur glace, et bien mélangé avant de prélever 45 ml dans un tube conique de 50 ml, lui aussi conservé dans la glace : cet échantillon est le « temps zéro » de réparation (+UV). Le volume restant de PBS (environ 210 ml), contenant la souche irradiée, est transféré dans 4 tubes coniques de 50 ml et centrifugé à 3200x g pour 1,25 min. Le surnageant est retiré et les culots égouttés par inversion sur un papier buvard. Les culots sont resuspendus dans 250 ml de milieu YePD

frais préchauffé à 30°C et les levures sont incubées à cette température 4h dans le noir. Les échantillons « -UV » et « +UV » sont centrifugés pour 1,25 min à 3200x g, le PBS est retiré et les tubes sont inversés sur du papier buvard afin de bien retirer le surnageant restant. Les 2 culots sont resuspendus dans 1,5 ml de tampon A froid (15 mM Tris-HCl pH 7,4, 80 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5 mM spermidine, 0,2 mM spermine), puis transférés dans un tube de polypropylène de 14 ml à fond arrondi (Becton Dickinson Labware.) contenant 1,5 ml de billes de verre (425-600 pm. Sigma) préalablement rincées avec 2 ml de tampon A. Ce tube est congelé à -80°C dans une cuve de métal afin d’éviter un contact avec la lumière. Aux temps de collecte de 30 min, 60 min, 2 heures et 4 heures, 50 ml de culture sont collectés dans un tube conique de 50 ml, centrifugé 1,25 min à 3200x g et le culot est resuspendu dans 45 ml de PBS pour, par la suite, effectuer la même procédure que pour les échantillons « - UV » et « + UV » préalablement collectés. Au final, 6 échantillons ont été collectés : - UV, + UV, 30 min, 60 min, 2h et 4h.