Conséquences sur le système astrocytaire : Immunoréactivité à la protéine GFAP

Chez les animaux traités à l’acétate de sodium, la moyenne des cellules immunoréactives à la GFAP (ir-GFAP) comptées dans le SCN est de 33±2,2. Lorsque comparés aux contrôles, les rats traités à l’acétate de plomb présentent une diminution significative de la moyenne des cellules ir-GFAP, la moyenne des cellules comptées étant de 23±2.4 (test de Mann Whitney, p< 0,05 ; Figure 72, planche 15).

    Témoins Traités 0 10 20 30 40 * M o ye n n e d e s cel lu le s i m m u n o réac ti ves ir -G F A P    

Figure 72: le nombre de cellules immunoréactives ir-GFAP chez les rats traités à l’acétate de plomb comparé aux témoins. L’axe des ordonnées représente le nombre de cellules comptées dans le noyau suprachiasmatique. Témoins, n=6 rats; Traités à l’acétate de plomb, n=6 rats. * : comparaison par rapport au groupe contrôle *p<0,05. L’analyse statistique a été réalisée en utilisant le test de Mann-Whitney. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± ESM.

Planche 15: Immunoréactivité à la protéine GFAP dans le SCN chez les rats contrôles (A, x 4; A’, x 20) et chez les rats traités à l’acétate de plomb ( B, x 4; B’, x 20). CO: Chiasma optique, 3V : 3ème Ventricule.

Discussion

Chez les rongeurs nocturnes, le rythme circadien d’activité locomotrice est connu pour s'exprimer au moment de la transition lumière/obscurité avec une acrophase nocturne (Honma et al., 1978). Dans ce travail, la perturbation enregistrée dans le rythme de l’activité locomotrice en alternance Lumière/obscurité est en accord avec les données de la littérature qui ont rapporté que le plomb perturbe, en plus de l'organisation du comportement (Shafiq ur, 1999), le rythme circadien de l'activité locomotrice chez le rat (Collins et al., 1984, Shafiq ur et al., 1986) et le cycle veille-sommeil qui relève aussi de l'activité circadienne (Kumar and Desiraju, 1992). Nos résultats, associés à ceux de la littérature suggèrent fortement que le plomb altère la capacité de l'organisme à interagir avec son environnement.

Parmi les régions du système nerveux central où le plomb s’accumule préférentiellement en plus du cortex préfrontal, (Finkelstein et al., 1998) sont répertoriés la rétine et l'hypothalamus (Rojas-Castaneda et al., 2011) positionnant ces deux structures, SCN compris comme cibles privilégiées du plomb.

La rétine est l’une des structures du système nerveux central la plus exposée à de nombreux toxiques environnementaux parmi lesquels le plomb (Wang et al. 2006 ; Rojas- Castaneda et al. 2011), du fait de sa situation en dehors de la barrière hémato-encéphalique. Plusieurs études ont rapporté que l’exposition à des concentrations élevées en plomb entraîne des dysfonctionnements visuels importants, notamment observés dans la rétine mais aussi le cortex visuel chez le lapin, le rat et le singe (Otto and Fox, 1993). Dans la rétine, une exposition faible à modérée au plomb est responsable d'une perte élevée de cellules en bâtonnets par mécanisme apoptotique qui a été corrélée à une perte concomitante du contenu en rhodopsine Fox et al. (1997). Ces auteurs apportent une preuve expérimentale solide et en faveur de l'induction de la mort cellulaire par ce métal lourd, qui pourrait en partie être à l'origine des résultats obtenus dans le présent travail quant à la défaillance dans l'intégration du message photique. Les dysfonctionnements enregistrés dans la synchronisation du rythme d'activité locomotrice en LD chez le groupe traité à l’acétate de plomb pourraient ainsi être dus à une dérégulation dans la perception du message photique par la rétine via l’accumulation du plomb dans cette structure.

L'entraînement de l'horloge circadienne par la lumière implique les cellules ganglionnaires rétiniennes à mélanopsine (Berson et al., 2002) qui reçoivent des afférences modulatrices à partir des cellules à cônes et à bâtonnets (Berson et al., 2002, Belenky et al., 2003). L'absence de bâtonnets, de cônes et/ou de cellules ganglionnaires à mélanopsine abolit toutes les réponses non visuelles à la lumière (Hattar et al., 2003). Chez les rats traités à

l’acétate de plomb, l’entrainement de l'activité locomotrice après une avance de 6 heures dans l'allumage/extinction est identique quand comparé aux contrôles comme le reflète les actogrammes obtenus, mais l’angle de phase d’entrainement n’est pas stable chez les rats traités à l’acétate de plomb, qui mettent plus de temps pour réajuster la période du rythme sur la nouvelle photopériode. Il semblerait que le plomb induit des troubles dans la cinétique de perception du stimulus lumineux en affectant probablement la vitesse d'intégration de l'information photique par les cellules rétiniennes impliquées dans la synchronisation de l’horloge circadienne par la lumière.

La perturbation du rythme de l’activité locomotrice en alternance Lumière/obscurité, et donc la synchronisation de ce rythme par la lumière pourrait également relever du fait que l’acétate de plomb interagirait sur les mécanismes de transfert de l’information lumineuse par altération de la voie rétino-hypotalamique directement via le tractus rétino-hypothalamique et/ou indirectement via le tractus rétino-géniculo-hypothalamique.

Pour étayer cette hypothèse, nous avons examiné l’effet du traitement de l’acétate de plomb sur l’expression de la protéine FOS en réponse à un stimulus photique, celle-ci étant utilisée largement comme marqueur de l'intégration des stimuli photiques (Masana et al., 1996). Les résultats obtenus montrent que l’acétate de plomb entraîne une diminution drastique de l’expression du FOS induit par la lumière dans le SCN chez les rats en plombémie, alors que chez les contrôles, cette protéine est largement exprimée après flash lumineux, comme préalablement montré dans le SCN chez le rat (Park et al., 1993) et chez d’autres espèces de rongeurs (Janik et al., 1995).

Chez la plupart des Mammifères, y compris le rat, la région ventrolatérale du SCN est connue pour recevoir l’information photique en provenance de la rétine directement via le tractus rétino-hypothalamique, principalement glutamatergique (Liou et al., 1986), mais également indirectement en passant par un relais intermédiaire qui sont les feuillets intergéniculés latéraux (IGL) et projetant sur le SCN par une voie à NPY (Moore and Card, 1994). En outre, il est connu que ce sont les cellules ganglionnaires à mélanopsine qui participent à la formation du RHT et qui libèrent du glutamate dans le SCN (Gooley et al., 2001, Hannibal et al., 2002, Hattar et al., 2002) mobilisant les récepteurs de type N-Methyl- D-Aspartate (NMDA) (Ding et al., 1994, Shibata et al., 1994) et entraînant l’expression de la protéine FOS via l’activation de la voie de signalisation cellulaire. Chez les rats traités à l’acétate de plomb, la diminution du nombre des cellules ir-FOS serait la conséquence d'un dysfonctionnement dans la voie de transduction et transfert du signal photique. Il a été, en effet, rapporté que le système glutamatergique est l’un des systèmes de neurotransmission le

plus fortement altéré par l’exposition au plomb, ce métal inhibant fortement la transmission glutamatergique par blocage des récepteurs NMDA (Alkondon et al., 1990), qui a pour conséquences l'accumulation du glutamate, induction des mécanismes d'excitotoxicité, et mort neuronale (Pinard et al.1999). Le quasi blocage de l’induction de la protéine FOS par la lumière dans le SCN des rats traités à l’acétate de plomb, mettrait à contribution l'effet inhibiteur de ce métal sur ce type de récepteur, et pourrait être à l'origine d'une perte de cellules ayant la capacité d'exprimer la protéine FOS, et de ce fait être à l'origine de la perturbation de la synchronisation du rythme d'activité locomotrice par la lumière. Il est intéressant, de noter par ailleurs que chez les rats traités à l’acétate de plomb, l’ir–FOS persiste même si elle est très faible par rapport aux contrôles. Ce résultat qui semble à priori contradictoire, pourrait être expliqué par le maintien de la fonctionnalité d'une partie de cette voie, et/ou le transfert du message photique aux SCN via la voie rétino-géniculo- hypothalamique. Les projections rétiniennes vers ce noyau libèrent du glutamate qui mobilise des récepteurs autres que les NMDA (Takeuchi et al., 1991, Abe et al., 1992, Colwell and Menaker, 1992) et les fibres composant le tractus géniculo-hypothalamique (GHT) sont GABAergiques et à NPY (Moore and Card, 1994). L’expression persistante du FOS dans le SCN serait ainsi induite par l'intervention de cette seconde voie photique, paraissant moins exposée aux effets toxiques du plomb.

Chez la plupart des Mammifères, y compris le rat, la région ventro-latérale du SCN est connue pour contenir les cellules à VIP (van den Pol and Tsujimoto, 1985, Tanaka et al., 1993), qui reçoivent des contacts synaptiques directs du tractus rétino-hypothalamique (Ibata et al., 1989), et qui co-expriment le FOS après le flash lumineux. De plus, chez le rat, le VIP s'exprime rythmiquement avec une acrophase nocturne, ce rythme étant sous contrôle de l'alternance lumière/obscurité (Shinohara et al., 1993, Isobe and Nishino, 1996).

Dans la mesure où il a été rapporté que l’exposition au plomb induit des anomalies morphologiques des cellules du SCN (Rojas-Castaneda et al. 2011) et que les résultats de ce travail montrent des dysfonctionnements dans l'entraînement de l'activité rythmique de ce noyau par la lumière et dans l'expression de la protéine FOS, nous avons évalué l’effet de l’acétate de plomb sur l'activité neuropeptidergique et astrocytaire dans ce noyau. Les résultats obtenus montrent ainsi que le plomb entraîne une forte diminution du nombre de cellules immunoréactives au VIP, qui est corrélée à celle des cellules exprimant la protéine FOS, renforçant l'hypothèse que le déficit engendré par le plomb dans l'intégration et le transfert de l'information photique met à contribution non seulement le tractus rétino- hypothalamique, mais également un dysfonctionnement des cellules VIP ergiques, cellules

clés dans l'intégration de l'information photique et son transfert vers d'autres cellules du SCN telles que les cellules à VP, mais également vers d'autres structures cibles telles que la glande pinéale (GP).

La mélatonine est une hormone synthétisée uniquement pendant la phase obscure du nycthémère dans la GP (Vaughan et al., 1976), sa synthèse étant entièrement contrôlée par le SCN. La synchronisation du rythme circadien de la mélatonine est sous la dépendance de la synchronisation du message photique dans le SCN. Bien que le rôle de la mélatonine sur ses récepteurs dans le SCN ne soit pas bien élucidé, il se pourrait que cette hormone via ses récepteurs MT1 et MT2 fortement présents dans le SCN (Wan et al., 1999, Poirel et al., 2002) jouerait un rôle modulateur de l’activité de ce noyau. En effet, la capacité de la mélatonine à entraîner le rythme d’activité locomotrice du rat a été démontrée (Slotten et al., 2000), une infusion de celle-ci en conditions constantes d'obscurité permettant d’entraîner le rythme chez cette espèce (Pitrosky et al., 1999). Dans le cadre de ce travail, la perturbation des mécanismes de synchronisation du rythme d'activité locomotrice par la lumière après traitement au plomb pourrait également impliquer un effet délétère de ce métal lourd sur l'activité synthétique et sécrétoire de la glande pinéale.

Chez la majorité des espèces mammifères, la subdivision dorso-médiane du SCN, renferme des neurones synthétisant de la VP (Swaab et al., 1975, Vandesande et al., 1975, van den Pol and Tsujimoto, 1985), connus pour contrôler la rythmicité circadienne de nombreuses fonctions physiologiques et comportementales telles que la sécrétion circadienne du cortisol et de la corticostérone (Kalsbeek et al., 1992) et l’activité locomotrice et qui reçoivent des projections à partir des cellules à VIP de ce noyau (Bosler ,1992). Dans ce travail, nous confirmons cette distribution, avec une forte présence des neurones VP chez les contrôles, avec cependant une diminution drastique du nombre de cellules immunoréactives à la VP (ir- VP) suite au traitement de l’acétate de plomb. Ce résultat montre que ce métal, comme décrit pour la dopamine, la noradrénaline, la sérotonine et l’acétylcholine (Kala et Jadhav, 1995b, Sabbar et al 2012), exerce une action délétère sur les neuropeptides, du moins dans le noyau suprachiasmatique. Les dysfonctionnements induits par l’acétate de plomb dans la synchronisation du rythme d'activité locomotrice dans le présent travail découleraient ainsi de l'effet délétère de ce métal sur les voies de transfert, mesurées par le FOS, les mécanismes d'intégration intra-suprachiasmatique mesurés par le VIP et les voies de sorties révélées par la VP.

Chez les rongeurs nocturnes, le rythme circadien d’activité locomotrice est entièrement sous la dépendance des SCN et présente une acrophase nocturne (Norton et al

1975, Honma et al, 1978), ce qui est le cas dans le cadre de cette étude chez les rats contrôles mais aussi chez les rats traités à l’acétate de plomb, suggérant que les mécanismes de l'horloge circadienne endogène restent en parfait fonctionnement. Cependant, les rats en plombémie présentent un dysfonctionnement en terme de quantité globale d’activité nocturne, reflété par un affaissement de l’acrophase en phase d'obscurité ce qui suggère que le plomb pourrait affecter l'activité propre du SCN de ces animaux, engendrant des changements dans l’activité cellulaire et moléculaire de ce noyau. Le rythme de l’activité locomotrice est en effet entièrement sous la dépendance des oscillations moléculaires des gènes de l'horloge que l’horloge principale qui va distribuer les rythmes synchronisés aux autres structures du cerveau ou des organes endocrines. Les neurones à VP sont connus pour renfermer ces gènes de l’horloge (Sun et al., 1997b, Shearman et al., 2000, Reppert and Weaver, 2001) dont les protéines agissent comme étant les acteurs des boucles moléculaires de rétroaction positives et négatives. Dans la mesure où l'activité rythmique totale nocturne s'effondre suite au traitement par le plomb, nous avons abordé les conséquences de ce traitement à l’acétate de plomb sur l'expression des protéines codées par les gènes horloges. Dans ces conditions de toxicité, l'expression des protéines horloges BMAL1, PER1 et PER2 dans le SCN ont changé de manière significative, à l’exception des protéines CRY1 et CRY2. En effet, nous montrons une forte diminution du nombre des cellules ir-BMAL1 révélée chez les rats traités à l’acétate de plomb lorsque comparés à leurs contrôles, dénotant un effet délétère du plomb sur les mécanismes de l'horloge. Il a été rapporté que le gène Bmal1 et le gène clock sont les acteurs principaux de la boucle positive, dans la mesure où le dimère CLOCK-BMAL1 a pour rôle d'activer la transcription rythmique des autres gènes horloge (Gekakis et al., 1998, Hogenesch et al., 1998). Ainsi, la diminution de cellules ir-BMAL1 induite par le plomb aura comme conséquence la perturbation du fonctionnement de l’horloge moléculaire via l’altération de la transcription des autres gènes horloges. Il a été démontré que en alternance lumière / obscurité, la rythmicité de l’activité locomotrice chez les mutants du gène Bmal1 (Bmal-/-), est moins marquée avec une activité de jour représentant 21% de l’activité locomotrice totale contre seulement 4% chez la souche sauvage (Bunger et al., 2000) ce qui pourrait expliquer la perturbation de rythme de l’activité locomotrice circadienne qui se manifeste par une activité de jour élevée chez les rats traités à l’acétate de plomb. Chez ces souris mutantes, Bunger et ses collaborateurs (2000) ont démontré que les niveaux d’ARNm des autres gènes horloges sont quasiment nuls, ce qui donnerait aussi un sens à la faible expression des protéines PERs obtenue chez les rats traités à l’acétate de plomb.

En obscurité totale, les rats traités à l’acétate de plomb continuent à exprimer un rythme d'activité locomotrice avec une période proche à 24h, excepté deux rats qui deviennent complètement arythmique dans ces conditions. Vu d’ensemble, le traitement à l’acétate de plomb engendre une faible expression des protéines BMAL1, PER1 et PER2 qui aurait comme conséquence l'effondrement de l'acrophase nocturne. L'absence de rythme chez deux rats, pourrait être dû à une altération profonde des gènes codant pour PER1 et PER2, par analogie avec les souris doubles mutants Per1-/- Per2-/- qui sont arythmiques en DD (Bae et al., 2001, Zheng et al., 2001).

Les mécanismes par lesquels le plomb induirait ces perturbations dans le fonctionnement de l’horloge moléculaire sont encore inconnus. Cependant, l’hypothèse que la dopamine modulerait l’expression des gènes horloges est non négligeable. La DA serait en effet impliquée dans la régulation de l'expression des gènes horloge extra-SCN, dans la mesure où l'activation des récepteurs D2 module les effets circadiens de la lumière sur l'activité locomotrice chez la souris (Doi et al., 2006) régule l'expression des gènes de horloge de la rétine (Besharse et al., 2004, Yujnovsky et al., 2006) et du striatum (Vitaterna et al., 1994, Sahar et al., 2010), une région importante pour le contrôle moteur, l'apprentissage et la cognition.

Le fonctionnement du SCN, comme toute structure du système nerveux central, est basé sur le fonctionnement neurone-glie et que la perturbation de ce couple de cellules nerveuses affectera le fonctionnement normal de l’horloge circadienne et par conséquent celles des fonctions physiologiques qui sont liées à cette structure. Cette hypothèse est soutenue par le fait que les astrocytes peuvent accumuler et stocker du plomb (Tiffany- Castiglioni et al., 1986). L'accumulation du plomb par les astrocytes est un mécanisme de protection des neurones contre les effets néfastes de ce métal lourd (Tiffany-Castiglioni, 1993). Toutefois, le plomb stocké dans les astrocytes est libéré de manière continue dans l'espace intercelluaire, contribuant, ainsi à la toxicité des neurones adjacents ou des cellules gliales elles-mêmes (Struzynska, 2009). Dans ce travail, une diminution significative des cellules ir-GFAP dans le SCN a été observée, et cette baisse qui indiquerait une défaillance dans le système de protection neuronale, peut contribuer aux altérations dans la fonction de l’horloge circadienne. Il s’avère, en effet, que l'interaction neurones VIP - astrocytes semble impliqué dans ce mécanisme (Prosser et al., 1994, Aton and Herzog, 2005). Le plomb induirait, donc, une mort par apoptose des cellules à GFAP et des cellules à VIP et à VP, et / ou une comme rapporté par Sharifi et ses collègues (2002) dans l’hippocampe.

En conclusion, le plomb pourrait affecter le fonctionnement normal du SCN, siège de l’horloge circadienne principale probablement en agissant sur l’expression des gènes horloges qui contrôlent la rythmicité circadienne, en modifiant l’activité métabolique et la transmission nerveuse dans le noyau suprachiasmatique. Dans ce noyau, ce métal inhiberaient la synthèse de la VP et du VIP, et probablement induirait la mort cellulaire par apoptose non seulement des neurones du SCN mais aussi les cellules gliales. Par conséquent, ces dysfonctionnements vont se manifestent sur le comportement de l’activité locomotrice circadienne, et probablement sur d'autres fonctions contrôlées par le SCN.

Conclusions Générales 

et Perspectives 

Conclusions générales

Le présent travail a eu pour objectif d'établir une corrélation de cause à effet entre les propriétés neurotoxiques du plomb en tant qu’agent polluant de l’environnement, et le développement de processus dégénératifs de type Parkinson et/ou l'induction du Parkinsonisme. Dans ce cadre, les résultats qui découlent de ce travail apportent de nouvelles preuves expérimentales quant à l'implication du plomb dans l'induction de ce type de syndrome. Ainsi, nous avons montré que le traitement à l’acétate de plomb induit une déplétion NAergique, et une déplétion DAergique, responsables de l’altération du comportement moteur et non-moteur. Ces déficits sont associés à une désorganisation de l'activité électrique des neurones du noyau sous-thalamique.

Sur le plan comportemental, les résultats obtenus dans ce travail montrent que le plomb affecte fortement les fonctions motrices et non motrices, en particulier la coordination motrice, l’activité locomotrice, le comportement explorateur, et l’humeur. Concernant le comportement explorateur, nous avons mis en évidence une dissociation entre la composante horizontale et verticale, ce qui n’a jamais été rapporté lors de la neurotoxicité au plomb. Nous avons aussi démontré que l’intoxication au plomb induit une perturbation du rythme de l’activité locomotrice générale circadienne, qui se manifeste par une augmentation de l’activité diurne chez les rats traités à l’acétate de plomb, et une perturbation des mécanismes de synchronisation du rythme par la lumière.

Sur le plan électrophysiologique, nous avons démontré, et ce, pour la première fois, que le plomb altère l’activité neuronale du noyau sous-thalamique en augmentant la proportion des neurones déchargeant de façon irrégulière et en bouffées. La déplétion DAergique, classiquement obtenue dans les modèles expérimentaux du Parkinson est également induite par le plomb, ce métal pouvant être, en partie, la cause de syndrome de type Parkinson-like. La déplétion NAergique observée après le traitement à l’acétate de plomb