Conditions de l’adhésion et de la formation de biofilm chez S. woodyi

woodyi

Les processus d’adhésion et de formation de biofilm sont des stratégies de survie utilisées à peu près par toutes les bactéries qui permettent aux microorganismes d’accéder plus facilement aux nutriments et de se protéger contre les différents stress environnementaux (Dunne, 2002). Par exemple, dans les écosystèmes aquatiques naturels, les microorganismes associés à une surface sont nettement plus nombreux que les organismes en suspension (Chellaram et al., 2012). Ceci peut être expliqué par le fait que les nutriments dans ces écosystèmes ont tendance à se concentrer près d'une surface solide (Davey and O’toole, 2000; Dunne, 2002). La fixation bactérienne à une surface peut être divisée en plusieurs phases distinctes : l'adhésion primaire réversible, l'adhésion secondaire irréversible et la formation du biofilm (Teughels et al., 2006). Chacune de ces phases est contrôlée génétiquement par l’action d’un ou de plusieurs systèmes tels que le QS ou le c-di-GMP. Plusieurs auteurs ont rapporté le rôle de QS dans la régulation de ces différentes phases chez plusieurs espèces bactériennes telles que P. aeruginosa (De Kievit et al., 2001), S.

liquefaciens MG1 (Labbate et al., 2004), V. anguillarum (You et al., 2007), S. baltica (Wang

et al., 2017) et Pantoea stewartii causant la maladie de Stewart chez les plantes de maïs (Koutsoudis et al., 2006).

Un des objectifs de ce travail est de déterminer le rôle régulateur de QS s’il existe, dans l’adhésion et la formation du biofilm chez S. woodyi dans le but de trouver à plus long terme des molécules pouvant inhiber la formation du biofilm chez cette bactérie en ciblant le QS. Afin de choisir les meilleures conditions expérimentales permettant d’étudier l’état

sessile de S. woodyi, un suivi de l’adhésion sur 24 h a été effectué dans le milieu ASW en utilisant plusieurs DO600nm de départ, 0,3, 0,5 et 0,8 (Figure 56). Parallèlement, un suivi de la formation du biofilm a été réalisé sur 72 h dans les deux milieux VNSS et ASW en partant également de plusieurs DO600nm initiales, 0,01, 0,1, 0,3, 0,5, 0,8 et 1 (Figure 57). L’intérêt de tester plusieurs concentrations bactériennes de départ est de choisir la concentration d’inoculum bactérien permettant d’obtenir un maximum d’adhésion et de biofilm dans ces conditions. Les résultats de ces deux suivis sont affichés dans les figures 56 et 57.

Figure 56. Suivi d’adhésion de S. woodyi en ASW.

Une culture de S. woodyi en phase post exponentielle de croissance a été centrifugée 10 min à 6000 rpm, le culot a ensuite été resuspendu en ASW et dilué de telle sorte à obtenir trois DO600nm différentes : 0,3, 0,5 et 0,8. Les cultures diluées ont été ensuite incubées à 20°C en conditions statiques dans des microplaques noires de 96 puits. L’adhésion a été évaluée après 3, 15 et 24 h d’incubation par mesure de la fluorescence (λ excitation=475 nm et λ émission=510 nm) en utilisant un lecteur de microplaque (TECAN, Infinite M 200 pro) après un marquage par le Syto9. Cette expérience a été réalisée trois fois en triplicat. Les conditions marquées d’astérisques sont significativement différentes (Bonferroni; ** :p<0,01; *: p < 0,05).

La figure 56 montre que S. woodyi a une capacité d’adhésion non négligeable dès 3 h excepté lorsque la DO600nm initiale est de 0,8. Ce qui peut être expliqué par le fait qu’au-delà d’une certaine concentration bactérienne, une compétition à adhérer sur la surface en question s’établit ce qui inhibe l’adhésion bactérienne précoce. L’adhésion atteint un maximum après 15 h d’incubation pour les trois inoculum (0,3, 0,5 et 0,8) et aucune différence significative n’est observée entre 15 et 24 h dans les trois cas. Puisque les valeurs sont importantes à 15 h et qu’il est difficile de distinguer la phase d’adhésion de la phase de formation de biofilm, le temps le plus précoce, 15 h, a été sélectionné pour la suite des expérimentations relatives à l’adhésion de S. woodyi. En revanche concernant le choix de l’inoculum, la plus petite valeur de DO600nm donnant la plus forte adhésion, c-à-d la DO600nm de 0,3, a été choisie. Donc, un

Thèse de Mahmoud HAYEK 2015/2018 Page 177 sur 290

temps d’incubation de 15 h et une DO600nm de 0,3 sont les conditions expérimentales utilisées pour effectuer nos expériences d’adhésion de S. woodyi.

Figure 57. Suivi de la formation de biofilm de S. woodyi en VNSS et ASW.

Une culture de S. woodyi en phase post exponentielle de croissance en VNSS a été diluée dans le même milieu pour obtenir plusieurs DO600nm, 0,01, 0,1, 0,3, 0,5, 0,8 et 1. Les cultures diluées ont été ensuite incubées à 20°C sans agitation dans des microplaques transparentes à 96 puits. La quantification du biofilm formé au fond des puits a été évaluée après 15, 24, 48 et 72 h d’incubation en mesurant la DO570nm en utilisant un lecteur de microplaque (TECAN, Infinite M 200 pro) après un marquage au cristal violet. Pour le suivi de la formation de biofilm en ASW, la même démarche expérimentale a été effectuée mais dans ce cas, la culture de S. woodyi en VNSS a été centrifugée à 6000 rpm pendant 10 min et le culot resuspendu puis dilué en ASW. Cette expérience a été réalisée trois fois en triplicat.

La figure 57 montre le suivi de la formation de biofilm formé par S. woodyi pendant 72 h dans les milieux VNSS et ASW. Dans ces deux milieux, le profil de formation du biofilm est semblable bien que des valeurs plus élevées soient observées en ASW, qui est un milieu salin pauvre en source de carbone. L’observation d’une formation plus importante de biofilm en milieu ASW par rapport à des milieux riches comme le VNSS ou le LB a déjà été

0 1 2 3 4 5 6 7 0,01 0,1 0,3 0,5 0,8 1 B iof il m (D O⁵ 7 0 n m ) DO_600nminitiale

VNSS

ASW

faite par le passé au laboratoire avec une autre souche de Shewanella (Learman et al., 2009; Linares et al., 2016). En VNSS et en ASW, les valeurs associées à la formation du biofilm augmentent progressivement avec le temps pour atteindre un plafond après 48 h d’incubation. Dans la mesure où notre objectif est aussi d’utiliser ce test pour évaluer l’inhibition du biofilm par des molécules potentiellement inhibitrices, le choix de la DO600nm s’est reporté sur la DO600nm initiale de 0,5 pour ne pas prendre une DO600nm initiale trop élevée mais aussi afin d’obtenir une formation de biofilm suffisamment importante pour visualiser une inhibition. Pour les expériences ultérieures relatives à la formation du biofilm en ASW, ont donc été choisi le temps d’incubation de 48 h et la DO600nm de 0,5.