Conclusions sur l’influence de la longueur de chaîne PEGylée et du mode de couplage peptidique à la

Les propriétés intrinsèques des TiONts et des AuNPs font de ces nanomatériaux des objets de choix pour des applications biomédicales. Dans le but de développer un nouvel outil thérapeutique, il est alors intéressant d’élaborer un nouveau nanohybride en combinant les TiONts et les AuNPs-DTDTPA. Ainsi, ces deux types de nanoparticules couplées, associent à la fois l’aspect de nanovectorisation (ou maintien sur site) via la forme en nanoaiguilles des TiONts et un effet thérapeutique accru grâce à l’effet radiosensibilisant des AuNPs, tout en permettant de l’imagerie (CT, nucléaire ou IRM, grâce au DTDTPA dans ces deux derniers cas).

III. Modification de surface des nanoparticules pour

améliorer leur stabilité colloïdale en milieu

physiologique

Les molécules liées à la surface des nanoparticules ne contrôlent pas seulement leur croissance durant la synthèse mais empêchent aussi l’agglomération des nanoparticules en suspension dans un milieu spécifique et permettent, en outre, d’ajouter de nouvelles fonctions organiques plus réactives pour de futurs greffages. Le type de particule (chimie), sa taille, sa charge de surface et les caractéristiques du solvant dans lequel les nanoparticules sont dispersées (type, température, pH), sont les principaux paramètres qui vont conditionner la stabilité colloïdale. En théorie, les nanoparticules sont stables si le potentiel total entre les particules a une barrière de potentiel qui est plus haute que l’énergie thermique (KBT). Le potentiel total des nanoparticules vient approximativement de quatre

contributions : les forces attractives sont celles de van der Waals (VdW) et magnétiques et les forces répulsives que sont les potentiels électrostatique et stérique [188]. En considérant ces contributions, les nanoparticules peuvent être stabilisées soit électrostatiquement soit stériquement pour réduire l’agglomération induite à travers les forces attractives de VdW notamment. À travers l’Équation 1 qui définit approximativement le potentiel attractif de VdW [189], les nanoparticules les plus petites induisent des forces de VdW plus faibles et sont donc moins susceptibles de s’agglomérer et décanter.

Équation 1 : Équation décrivant les forces de VdW pour des particules sphériques (r est le rayon de la sphère ; D est

la distance interparticulaire ; A est la constante de Hamaker).

Par conséquent, l’amélioration de la stabilité colloïdale peut être envisagée par différentes stratégies à l’aide de greffage de molécules en créant des forces répulsives qui reposent sur les répulsions électrostatiques, stériques ou en combinant les deux méthodes (électro-stérique). Les ligands et les nanoparticules peuvent être liés soit par chimisorption, attraction électrostatique (physisorption) généralement avec leur groupement chargé se trouvant sur une des extrémités du ligand [190].

Pour des applications biomédicales, la stabilité colloïdale des nanoparticules est un prérequis obligatoire car leur déstabilisation dans le milieu physiologique peut conduire à une accumulation néfaste dans les organes ou encore à diminuer leur temps de circulation dans le sang en empêchant de délivrer l’agent thérapeutique sur les sites ciblés [27, 67, 73, 191, 192]. Les milieux physiologiques comme le système sanguin contiennent une grande quantité de sels, ont un pH d’environ 7,4 à 37°C et une force ionique élevée [193]. La stabilisation électrostatique pour les nanoparticules est seulement efficace pour des forces ioniques faibles et pour des pH éloignés du point isoélectrique (pH pour lequel les particules présentent autant de charges négatives que de charges positives, appelé PIE). C’est pourquoi la stabilisation colloïdale des nanoparticules par voie stérique est de plus en plus développée pour améliorer la stabilité dans un milieu à haute concentration saline [27, 194].

Il est donc nécessaire de modifier la surface des nanoparticules et de simuler leur comportement dans un milieu physiologique car la plupart des nanoparticules synthétisées ne sont pas stables dans les milieux biologiques [15, 36, 188, 190, 195]. Ceci permet aussi d’apporter de nouvelles fonctions réactives pour des couplages futurs avec des molécules d’intérêts (Figure 26).

Figure 26 : Exemple de nanomatériaux et de leurs groupements fonctionnels pour des applications biologiques

Modification de surface des nanoparticules pour améliorer leur stabilité colloïdale en milieu physiologique

Comme énoncé précédemment, les modèles utilisés dans l’Équation 1 sont appliqués pour des particules de morphologie sphérique. Or, le nanomatériau au cœur de cette thèse ayant une forme tubulaire, aucune théorie reposant sur la mesure de diffusion dynamique de la lumière n’est à ce jour adéquate pour analyser la stabilité colloïdale des TiONts. Après plusieurs échanges avec la société Malvern Instruments⁷ et des essais infructueux, un modèle approprié pour les morphologies allongées n’a pas été trouvé mais est en développement.

III.1. Stabilisation par voie électrostatique

La stabilisation par voie électrostatique s’appuie sur les interactions entre les particules décrites par la théorie DLVO (Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek) [197]. La stabilisation colloïdale du système dépend du potentiel ζ des nanoparticules en fonction du pH [198], qui induit des forces électrostatiques répulsives plus efficaces avec une surface davantage chargée (Figure 27).

Figure 27 : Illustration de stabilisation colloïdale par voie électrostatique entre deux nanoparticules chargées

positivement [18].

En effet, les charges de surface des nanoparticules, à l’issue de la synthèse ou par le greffage post-synthèse de molécules avec divers groupements chargés, ont pour but d’augmenter l’épaisseur de la double couche ionique et d’améliorer le potentiel électrique (Figure 28). Les nanoparticules peuvent être stabilisées de manière électrostatique pour des pH bien inférieurs ou supérieurs au PIE [199]. Cependant, les interactions électrostatiques entre nanoparticules peuvent être écrantées si des ions sont ajoutés [200]. Par conséquent, la stabilisation par cette voie est efficace pour une faible concentration en sel et avec des pH s’éloignant du PIE.

Les agents stabilisants les plus utilisés sont surtout des silanes, des catéchols et des phosphonates présentant une forte affinité avec la surface des nanoparticules d’oxydes [88, 190] et possédant une surface chargée via des amines [201, 202] et des carboxylates [195, 203, 204] principalement. Ces groupements s’avèrent efficaces pour stabiliser les nanoparticules dans le temps selon leur nature et aussi, pour des milieux salins plus concentrés [190].

7

Malvern Instruments est une société qui développe des appareils analytiques utilisés dans les laboratoires. Ces instruments permettent de mesurer la taille hydrodynamique, la forme des particules, le potentiel zêta, la charge des protéines, les interactions biomoléculaires,…

Figure 28 : Évolution du potentiel de répulsion électrostatique entre deux nanoparticules chargées à deux forces

ioniques différentes I1 et I2 (₀ représente le potentiel de surface des nanoparticules, _d le potentiel électrostatique du plan externe d’Helmholtz (OHP) assimilable au potentiel ζ, _ est le potentiel électrique au plan interne

d’Helmholtz (IHP)). D’après [205].

III.2. Stabilisation par voie stérique : choix du polyéthylène glycol

Cette stratégie a pour but d’améliorer la stabilité en milieu physiologique par encombrement stérique [89] et pour augmenter le temps de circulation des nanoparticules dans le sang tout en évitant l’adsorption des opsonines [27]. Les molécules permettant la stabilisation colloïdale des nanoparticules par voie stérique sont beaucoup plus efficaces à des concentrations salines élevées, par rapport aux molécules agissant par la voie électrostatique [206]. Les molécules classiquement utilisées sont des polymères comme le dextran [90], l’alcool polyvinylique [207], le chitosan [84] et le PEG [89, 192] (Figure 29).

Figure 29 : Illustration de stabilisation colloïdale par voie stérique entre deux nanoparticules [18].

Le PEG est le plus couramment utilisé car il est reconnu comme étant biocompatible, soluble en milieu aqueux, non toxique et approuvé par la FDA. D’ailleurs, il a déjà fait ses preuves pour favoriser l’accumulation passive des nanoparticules par effet EPR et améliorer l’efficacité thérapeutique [14, 208]. Il est rare de trouver des études avec des longueurs de chaînes supérieures à 20 kDa [14, 27]. Par sa

Fonctionnalisation des nanomatériaux par une molécule d’intérêt

longueur de chaîne, le PEG permet d’écranter les charges afin de tendre vers un potentiel neutre⁸ [192], ce qui favorise une élimination des nanoparticules moins importante par le foie. À ce jour, peu d’études relatent l’effet de la densité et de la longueur de la chaîne carbonée du PEG sur l’adsorption des protéines sur les nanoparticules. Cependant, il a été établi qu’une densité de PEG élevée et une taille de chaîne PEGylée plus importante à la surface des nano-objets permettent de réduire l’adsorption des protéines, d’améliorer la stabilité colloïdale des nanoparticules ainsi que leur internalisation par les cellules [209, 210]. Il est alors nécessaire de trouver un compromis entre le taux de greffage et la longueur de PEG utilisée.

En raison de son essor récent comme nanomatériau d’intérêt, le nombre d’études sur le greffage d’un polymère, et notamment le PEG, à la surface des TiONts est très faible dans la littérature surtout pour des applications biomédicales [89, 124].

III.3. Stabilisation par voie électro-stérique

La dernière stratégie consiste à combiner les deux précédentes méthodes c’est-à-dire à stabiliser les nanoparticules à la fois par voie électrostatique et par voie stérique. Ce chemin est possible dans le cas de certains polymères [211] ou dendrimères [53, 212] par exemple. Dans le cas des TiONts pour applications médicales, la polyéthylène imine (PEI) a été greffée pour jouer le rôle de dispersant cationique et comme agent de transfection [26, 89]. En effet, ces nombreuses fonctions amines se protonent facilement afin d’acquérir une surface chargée positivement au pH physiologique tout en ayant une stabilisation stérique du fait de la longueur de la chaîne carbonée (PEI 1800 Da). La molécule de DTDTPA peut jouer le rôle de stabilisateur électro-stérique comme c’est le cas durant la formation des AuNPs. Ses nombreuses fonctions carboxylates induisent une charge négative à pH 7,4 et ses fonctions thiols, de part et d’autre de la molécule, permettent de former des ponts disulfures entre elles créant un encombrement stérique (Figure 22) [163].

IV. Fonctionnalisation des nanomatériaux par une

molécule d’intérêt

Les modifications de surface des nanomatériaux vues précédemment sont indispensables et permettent d’une part de rendre plus stables les suspensions dans les conditions physiologiques et, d’autre part, de préparer la surface afin qu’elle puisse accueillir un agent thérapeutique (administration

8

Notons que le potentiel zêta représente la charge électrique qu'une particule acquiert grâce au nuage d’ions qui l’entourent quand elle est en suspension ou en solution. C’est donc la différence de potentiel entre le milieu de dispersion et le potentiel au plan de cisaillement qui définit le potentiel zêta. Ainsi, les chaînes carbonées du polymère à la surface des nanoparticules ont tendance à accroître la distance entre le plan de cisaillement et la nanoparticule lors de la mesure du potentiel zêta, ce qui a pour conséquence de masquer les charges se trouvant plus en profondeur. Dans ce manuscrit, nous parlerons alors dans ce cas de phénomène d’écrantage des charges.

ciblée du médicament) et un agent chélatant pour le suivi des nanovecteurs in vivo par différentes techniques d’imagerie médicale.

IV.1. Greffage d’un agent thérapeutique à la surface de

nanoparticules

IV.1.1. Généralités sur l’utilisation combinée de plusieurs médicaments

et/ou de plusieurs types de thérapie. L’intérêt des nanoparticules.

Pour l’heure, les combinaisons de différents agents chimiothérapeutique dans les traitements thérapeutiques sont une stratégie attractive pour améliorer l’efficacité des traitements anticancéreux [213]. Les principaux facteurs conduisant à un pronostic défavorable lors de l’utilisation d’un agent chimiothérapeutique seul sont le phénomène de résistance multiple aux médicaments (Multidrug Resistance en anglais, MDR) [3], des toxicités significatives et des effets secondaires indésirables [4]. L’utilisation combinée de principes actifs pour la thérapie contre le cancer est illustrée Figure 30.

Figure 30 : Représentation schématique des principaux avantages de l’utilisation combinée de plusieurs agents

thérapeutiques pour la thérapie anticancéreuse [213].

L’association de plusieurs agents thérapeutiques peut créer un effet synergétique i.e. un effet thérapeutique plus efficace que la somme des effets des principes actifs pris individuellement [214]. Enfin, un des plus gros obstacles rencontrés en thérapie concerne le problème de toxicité systémique en fonction des doses administrées. De fortes doses sont généralement requises lors des traitements chimiothérapeutiques en raison de la difficulté des principes actifs à atteindre les sites tumoraux. C’est pourquoi la combinaison synergique de plusieurs agents conduit à diminuer la toxicité et les effets secondaires tout en permettant de réduire le dosage de chacun des composés. Une étude a montré que l’association de la curcumine avec le paclitaxel a permis de réduire les doses pour limiter la toxicité du paclitaxel lors des injections systémiques mais a aussi permis d’améliorer l’activité cytotoxique, sur des cellules HeLa, par rapport aux médicaments seuls [215]. Dans le même but, cette même molécule a été combinée avec le carboplatine ou avec la vinorelbine pour le cancer du poumon [216].

Fonctionnalisation des nanomatériaux par une molécule d’intérêt

Par ailleurs, le traitement du cancer implique généralement plusieurs thérapies combinatoires comme l’utilisation d’agents chimiothérapeutiques associés à de l’hormonothérapie, de la radiothérapie ou encore à de l’immunothérapie (Figure 31). Il a été montré que les principes actifs associés avec de la radiothérapie sont plus efficaces. En effet, les chances de survie du patient sont meilleures pour de nombreux cancers à des stades avancés comme c’est le cas pour la combinaison du 5-fluorouracile et de la mitomycine C avec la radiothérapie [217], par rapport à l’action radiothérapeutique seule [218].

Figure 31 : Schéma des différentes stratégies combinatoires pour le traitement du cancer [213].

Les stratégies présentées dans ce paragraphe peuvent être obtenues grâce à la nanomédecine. En effet, plusieurs types de nanovecteurs chargés avec de multiples agents thérapeutiques ont été caractérisés et ont démontré une amélioration de l’activité anticancéreuse (Figure 32 et Tableau 3) [219]. Les nanoparticules peuvent apporter une grande quantité de médicaments et les protéger contre la dégradation lors de leur transport. Ainsi, il est possible d’attacher plusieurs types de molécules thérapeutiques afin que plusieurs actions thérapeutiques soient simultanément menées, le tout de manière contrôlée. Enfin, la cinétique de libération des molécules anticancéreuses peut-être contrôlée selon la chimie de surface des nanoparticules et leur comportement dans les milieux biologiques [220]. Les nanoparticules permettent aussi d’avoir simultanément plusieurs thérapies telles que le ciblage d’agents chimiothérapeutiques combiné à de l’hyperthermie ou à de la radiosensibilisation (voir paragraphe ‎I.2.1.1. et ‎I.2.2.). De plus en plus de résultats cliniques émergent, ce qui suggère que cette voie est prometteuse et commence à se concrétiser.

Cependant, à l’heure actuelle, le nombre de nanomédicaments sur le marché est limité [221]. Abraxane, une version nanoparticulaire contenant le paclitaxel lié à l’albumine s’est avérée plus efficace que la formulation de paclitaxel seul. Cette nouvelle formulation a été l’une des premières à être approuvée par la FDA. Des molécules thérapeutiques anticancéreuses comme la doxorubicine, le paclitaxel, le cisplatine, la camptothécine, le méthotrexate et la fluorouracile (les plus utilisées d’après la littérature) ont déjà été greffées, caractérisées puis testées biologiquement sur des nanomatériaux. Parmi ces derniers, des nanotubes de carbones, des nanoparticules d’oxyde de fer, de silice et d’or ont été utilisés comme nanovecteurs pour délivrer ce genre d’agent thérapeutique [25, 196, 208].

Figure 32 : Quelques exemples des différents types de nanovecteurs développés pour la délivrance de médicaments

[213].

Fonctionnalisation des nanomatériaux par une molécule d’intérêt

IV.1.2. La famille des taxanes comme agents chimiothérapeutiques

La famille des taxanes fait partie de la classe des diterpènes, qui sont surtout connus pour être des antimicrobiens et des anti-inflammatoires [222]. La Figure 33 représente la structure moléculaire de base des taxanes. Il sont également très utilisés comme agents chimiothérapeutiques [223].

Figure 33 : Structure moléculaire de base des taxanes.

IV.1.2.1. Propriétés anticancéreuses et effets secondaires des taxanes

Les taxanes sont parmi les agents antinéoplasiques les plus utilisés par les cancérologues. Ces molécules sont couramment exploitées pour traiter des cancers avancés incluant un grand nombre de tumeurs solides comme celles du cancer du sein, des ovaires, de la prostate, de l’œsophage et des poumons [223, 224]. Les taxanes ont aussi démontrés leur efficacité pour des stades moins avancés, ce qui a permis d’avoir un grand impact pour la thérapie préventive. Cette famille comprend plus de 300 composés dont les plus connus sont le paclitaxel (PTX, nom commercial Taxol), le docétaxel (DTX, nom commercial Taxotère_{) et le cabazitaxel (nom commercial Jevtana}_{) (Figure 34). Il est nécessaire} de les dissoudre dans un solvant afin de les utiliser biologiquement car de manière générale, ils sont faiblement solubles dans l’eau [223]. En revanche, plusieurs rapports indiquent que ces solvants altèrent les profils pharmacocinétiques des taxanes [224].

Figure 34 : Structures moléculaires des taxanes les plus utilisés comme agents chimiothérapeutiques : le paclitaxel,

le docétaxel et le cabazitaxel.

Ces molécules inhibent la fonction des microtubules responsables de la division cellulaire [225]. De plus, les taxanes sont également connus pour présenter un effet radiosensibilisant [226]. Une étude a recensé plusieurs travaux sur l’action du paclitaxel et du DTX sur les différents cancers cités précédemment [223]. Globalement, dans ces types de cancers, les taxanes ont démontré une meilleure efficacité par rapport à d’autres agents pour lutter contre la progression de la tumeur. De plus, il s’est avéré que le taux de rechute et le risque de décès après un suivi post-traitement diminuait. C’est aussi le cas de la toxicité qui est moins importante avec les taxanes notamment en raison de leurs caractéristiques pharmacologiques [223].

Cependant, l’utilisation d’un taxane ou en combinaison avec d’autres agents antinéoplasiques peut causer de la toxicité [223]. Ces effets toxiques incluent une myélosuppression⁹, des réactions d’hypersensibilités et cutanées, de la rétention d’eau, des troubles gastro-intestinaux et de la neurotoxicité (Tableau 4). La neuropathie sensorielle est l’effet neurotoxique le plus généralement observé par les taxanes. Elle est devenue une question centrale dans le domaine de la chimiothérapie antinéoplasique bien qu’elle ne soit pas mortelle. Néanmoins, en France, l’utilisation du docétaxel pour traiter le cancer du sein a été temporairement suspendue, par précaution (début 2017), après le décès de plusieurs femmes, âgées de 46 à 73 ans, suite à des complications digestives. Le docetaxel est en revanche toujours utilisé pour d’autres cancers tels que ceux des poumons, prostate, ORL. Depuis juillet 2017, ce médicament peut à nouveau être utilisé dans le traitement des cancers du sein opérables, décision prise par l’Agence du médicament (ANSM) et l’Institut national du cancer (INCa). Les investigations menées au niveau européen « ne montrent pas d’augmentation de la fréquence des effets indésirables graves et des décès liés à cette molécule » et « le Comité pour l’évaluation des risques en matière de pharmacovigilance (PRAC) de l’Agence européenne du médicament (EMA) a clos la procédure d’alerte lancée par la France ». En effet, sur les vingt dernières années, les décès recensés sont de l’ordre de 1 pour 10 000 patients sur 600 000 patients traités d’après l’enquête nationale de pharmacovigilance. De plus, selon l’ANSM, le Comité estime que « l’augmentation du nombre de cas déclarés en France pour le cancer du sein pourrait être liée à une hausse de la vigilance des professionnels de santé »¹⁰.

Tableau 4 : Pourcentage de toxicité sur l’organisme lors du traitement du cancer du sein par deux des principaux

taxanes (PTX et DTX) et pour une formulation nanoparticulaire de l’un d’entre eux (Nab-PTX) [227].

IV.1.2.2. Choix du docétaxel

Parmi les taxanes, le DTX reçoit un intérêt grandissant depuis sa découverte et son élaboration par Pierre Potier en 1988.

9 La myélosuppression est une réduction de l’activité de la moelle osseuse provoquant une réduction du nombre de globules rouges, les plaquettes et les globules blancs. Elle est souvent observée comme un effet secondaire d’un médicament.

10 D’après l’article du monde ( http://www.lemonde.fr/sante/article/2017/07/05/cancers-du-sein-le-docetaxel-a-nouveau-autorise_5156156_1651302.html) et/ou le communiqué de presse de l’ANSM ( http://ansm.sante.fr/S-informer/Presse-Communiques-Points- presse/Docetaxel-levee-de-la-recommandation-d-eviter-son-utilisation-dans-le-cancer-du-sein-et-renforcement-de-l-encadrement-des-pratiques-Communique).

Fonctionnalisation des nanomatériaux par une molécule d’intérêt

Les formulations contenant le paclitaxel causent de fortes toxicités et nécessitent de fortes doses. En améliorant les étapes de synthèses du paclitaxel, Potier a synthétisé le DTX qui a montré alors une meilleure biodisponibilité et une activité supérieure par rapport au paclitaxel lors de tests in vitro et

in vivo [225]. Par rapport aux molécules thérapeutiques couramment utilisées, le DTX a un large spectre

d’activité contre de nombreuses tumeurs [223]. De plus, le DTX est considéré comme plus efficace que la doxorubicine, le paclitaxel et le fluorouracile comme agent cytotoxique antimicrotubule. Par