Cette étude a établi que les CDps intra-tumorales répondent à une stimulation in vitro par le CpG A : i) par la production d’IFN de type I, et ce de façon plus importante que les CDps spléniques de souris naïves, ii) par la production d’IL12p40 et de TNFα et des chimiokines CCL3, CCL4. L’ensemble de ces résultats, qui devront être confirmés, démontre que les CDps intra-tumorales sont capables de répondre à une stimulation in vitro par un ligand de TLR9 et semblent donc fonctionnelles.
DISCUSSION
Chez l’homme, les cellules dendritiques plasmacytoïdes sont retrouvées dans des tumeurs solides, dont les cancers de la tête et du cou, du sein, de l’ovaire, du poumon et de la peau (Lande and Gilliet, 2010; Vermi et al., 2011). La présence des CDps dans les tumeurs est généralement associée à un mauvais pronostic. Ainsi, dans le cancer du sein, un recrutement de CDps est associé à une augmentation du risque de dissémination de la tumeur et de rechute après traitement (Treilleux et al., 2004). Les CDps intra-tumorales sont généralement dans un état non activé. D’autre part, il a été montré que ces cellules ne produisent pas d’IFN de type 1 ex vivo (Vermi et al., 2011). Or, les IFN de type 1 ont des effets anti-tumoraux connus : ils jouent un rôle dans l’immunosurveillance en participant à l’activation des cellules de l’immunité innée (macrophages, NK) et adaptative (lymphocytes T et B). Des traitements utilisant des ligands de TLR7 (analogues de imidazoquinolines et guanosine) et TLR9 (CpG ODN), capables d’activer les CDps, conduisent à une régression de la tumeur, dans certains modèles, suggèrant que les CDps pourraient participer à l’élimination des cellules tumorales (Pinto et al., 2012; Vermi et al., 2011). Ainsi, les CDps semblent jouer un rôle important dans l’immunité anti-tumorale car ces cellules pourraient contribuer à l’établissement du microenvironnement tumoral immunosuppresseur, mais être aussi capables, une fois activées, d’induire une réponse conduisant à la régression de la tumeur (Pinto et al., 2012).
Mon projet a consisté à définir le phénotype et la fonctionnalité des CDps chez des animaux immunocompétents développant des tumeurs. Il s’inscrit dans un programme plus général de notre équipe ayant pour objectif de définir le rôle des CDps dans l’immunité anti- tumorale. Lors de cette étude j’ai i) analysé le recrutement et l’état d’activation des CDps dans un modèlel tumoral, ce qui a nécessité de définir les protocoles permettant une analyse multiparamétriques en cytométrie en flux ainsi que ii) mis au point le protocole de purification des CDps intra-tumorales pour étudier la fonctionnalité de ces cellules. Le modèle utilisé a été celui du mélanome murin B16 exprimant la protéine OVA, B16-OVA, injecté à des souris C57BL/6J par voie sous-cutanée.
Les CDps sont recrutées au sein de la tumeur B16-OVA
Nous avons montré que les CDps sont recrutées significativement au sein de la tumeur B16-OVA et que leur fréquence au sein de la population CD45.2+ augmente tout au long de son développement. Le nombre de CDps augmente également dans le ganglion drainant la
tumeur. A un stade avancé de la tumeur (diamètre moyen de 15 mm), ces cellules représentent en moyenne 2,5% des cellules CD45.2+ présentes dans le tissu tumoral. L’augmentation du nombre des CDps dans la tumeur B16-OVA signifie que celle-ci sécrèterait les chimiokines nécessaires à leur recrutement. Ces résultats corrèlent avec différentes études récentes réalisées chez l’homme et montrant l’accumulation de CDps dans plusieurs types de tumeurs (Hartmann et al., 2003; Lande and Gilliet, 2010; Treilleux et al., 2004). Zou et al (Zou et al., 2001) ont montré que les cellules de carcinomes ovariens exprimaient CXCL12, dont le récepteur CXCR4 est exprimé par les CDps. D’autre part, dans les cancers de la tête et du coup, l’expression de CXCR4 est augmentée à la surface des CDps en présence de PGE2 et de TGF-β sécrétés par les cellules tumorales, ce qui conduit au recrutement et à la rétention des CDps (Bekeredjian-Ding et al., 2009). Cependant, il n’existe encore aucune donnée chez la souris permettant d’expliquer le recrutement des CDps au sein du tissu tumoral et les mécanismes restent à élucider.
Les CDps montrent un profil différent selon le stade de développement de la tumeur B16-OVA
Au cours de cette étude, nous avons analysé l’expression par les CDps spléniques, ganglionnaires et intra-tumorales, de plusieurs marqueurs spécifiques tout au long de la croissance tumorale. Nous avons observé que le profil phénotypique des CDps dépendait du stade de développement de la tumeur.
Tout d’abord, le profil d’expression des marqueurs propres aux CDps, que sont B220, Ly6C et SiglecH, évolue au cours de la croissance tumorale. L’expression de PDCA1, quant à elle, n’est pas affectée.
Ainsi, nous avons observé une augmentation transitoire de l’expression de SiglecH à la surface des CDps intra-tumorales à un stade précoce du développement de la tumeur. Or, Zhang et al (Zhang et al., 2006) ont montré que SiglecH peut fonctionner comme un récepteur d'endocytose, servant de médiateur pour la capture de l'antigène par les CDps et sa présentation aux cellules T. Ceci suggère que les CDps intra-tumorales pourraient être impliqués dans la présentation de l’antigène au début de la croissance de B16-OVA. Les résultats que nous avons obtenus concernent les jours 15, 20 et 25 après la greffe tumorale et seront à confirmer et à compléter pour le jour 10.
été décrite pour ces deux marqueurs, nous ne pouvons pas tirer de conclusion de ces observations.
D’autre part, parmi les marqueurs d’activation étudiés (CD69, CD80, CD86, PDC- Trem et les molécules du CMH de classe I et II), nous avons montré que les CDps intra- tumorales exprimaient légèrement CD69 et CD86 à un stade précoce du développement de la tumeur, et que le marqueur PDC-Trem était fortement exprimé. L’expression de ces trois marqueurs diminue au cours de la croissance tumorale. Nos résultats suggèrent que les CDps intra-tumorales seraient partiellement activées au stade précoce de la croissance tumorale, alors que plusieurs études chez l’homme montrent que les CDps sont retrouvées à un stade non activé dans les tumeurs (Perrot et al., 2007; Sisirak et al., 2012). Il est à noter que les études chez l’homme sont généralement réalisées à un stade tardif du développement de la tumeur corrélant avec le fait que, dans notre étude, les CDps ne sont pas activées à des stades tardifs. Nous pouvons supposer que les CDps sont activées lors du recrutement dans le tissu tumoral puis que cette activation n’est pas maintenue. Il faut souligner notamment l’expression importante de PDC-Trem à la surface des CDps en début de croissance de B16- OVA. Il a été montré que PDC-Trem est directement lié à la production d’IFN de type I par les CDps (Watarai et al., 2008). Des résultats préliminaires du laboratoire ont montré que l’expression de PDC-Trem était dépendante de la présence d’IFN de type I dans leur environnement. De plus, SiglecH, dont l’expression est augmentée aux stades précoces, a été décrit comme ayant un rôle régulateur de la sécrétion d’interféron de type I (Blasius et al., 2006). L’ensemble de ces données suggèrent que de l’IFN de type I pourrait être sécrété par les CDps intra-tumorales à des stades précoces du développement de B16-OVA, puis, que les CDps n’en produiraient plus à un stade tardif de la croissance tumorale. Bekeredjian-Ding et al ont montré que, dans les tumeurs de la tête et du cou, la sécrétion de PGE2 et de TGF- β, par les cellules tumorales, inhibe la production d’IFN de type I par les CDps (Bekeredjian- Ding et al., 2009) ce qui suggère que l’environnement tumoral pourrait bloquer la production d’IFN par les CDps. Cependant, aucune donnée ne nous permet de conclure sur la nature des cellules productrices de ces IFN. Il faut noter que cette forte expression de PDC-Trem n’est pas retrouvée pour les CDps des organes lymphoïdes, et est donc propre aux CDps recrutées au sein de la tumeur.
Enfin, nous avons étudié quelques marqueurs d’interaction entre les CDps et les lymphocytes (ICOS-L, OX40-L, PDL1) et nous avons observé une évolution du profil d’expression de ceux-ci au cours du développement de la tumeur. Il semblerait que ICOS-L, soit particulièrement exprimé par les CDps à un stade précoce de la croissance tumorale dans
la tumeur et les organes lymphoïdes. Cependant, il est évident que ces résultats devront être confirmés car le nombre limité de cellules ne nous a pas permis d’avoir des résultats significatifs. Faget et al ont récemment mis en évidence l’importance de l’axe ICOS/ICOS-L entre les CDps et les lymphocytes T CD4+ dans l’élaboration d’un micro-environnement
immunosuppresseur dans le cancer du sein chez l’homme (Faget et al., 2012). Cette interaction a pour effet l’amplification des Treg et de la sécrétion d’IL-10. De plus, nos résultats montrent également une augmentation de l’expression de PDL1 à des stades précoces du développement de la tumeur. Une étude menée au laboratoire a montré que l’expression de PD1 augmentait à la surface de lymphocytes T CD4+ et CD8+ au sein de la tumeur. Or l’axe PD1/PDL1 est largement décrit comme étant impliqué dans l’inhibition de la réponse T (Francisco et al., 2010; Ohigashi et al., 2005). Gehrie et al (Gehrie et al., 2011) ont montré que les CDps murins pouvaient avoir un rôle tolérogène quand elles exprimaient l’IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase), ICOS-L et PDL1. Ces dernières données suggèrent que les CDps auraient effectivement une fonction tolérogène dans notre modèle qui reste encore à déterminer.
Les CDps intra-tumorales répondent à une stimulation par un agoniste de TLR9.
En fonction de l’état d’activation observé lors de nos expériences, il est important de déterminer la capacité fonctionnelle des CDps intra-tumorales, et en particulier leur capacité à produire de l’IFN de type I. Au cours de cette étude, j’ai mis au point un protocole de purification des CDps intra-tumorales, permettant d’obtenir une pureté supérieure à 98%. Les CDps purifiées à partir de rates naïves et de tumeurs ne produisent pas ou peu d’IFN en absence de stimulation. En revanche, une fois stimulées in vitro par un ligand du TLR9 (CpG ODN 2216), les CDps purifiées à partir de tumeur de type B16-OVA à un stade avancé (J25) sont capables de produire de l’IFN de type I, ainsi qu’un large panel de cytokines après stimulation. De plus, ces CDps intra-tumorales produisent plus d’IFN de type I après stimulation que les CDps spléniques d’une souris naïve. En effet, les CDps intra-tumorales produisent trois fois plus d’interférons de type I que les CDps spléniques après stimulation, ce qui pourrait suggérer un état activé des CDps intra-tumorales. Nous pouvons déduire de ces résultats que, bien que les CDps intra tumorales montrent un profil non activé à un stade tardif de la croissance tumorale, elles sont cependant capables de produire des cytokines en réponse à une stimulation adéquate.
chez l’homme et chez la souris (Drobits et al., 2012; Gibson et al., 2002; Holcmann et al., 2012). Néanmoins, nos résultats sont en contradiction avec l’étude de Le Mercier et al (Le Mercier et al., 2013) qui montrent que les CDps intra-tumorales purifiées à partir de cancers du sein humains ne sont pas réactifs à la stimulation par TLR9. Aucune étude, jusqu’à présent, n’a montré une production d’IFN par les CDps intra-tumorales après stimulation par un ligand de TLR9. Il est possible que ces résultats dépendent du modèle tumoral utilisé. Ainsi, des analyses sont en cours au laboratoire sur un autre modèle tumoral.
Dans l’ensemble, nos résultats montrent que les CDps sont recrutées par la tumeur, tout au long de la croissance de celle-ci. Alors qu’elles semblent légèrement activées au début de la croissance tumorale, les CDps perdent ce profil d’activation à des stades plus tardifs du développement de B16-OVA ; ceci pouvant être dû à l’absence de facteurs capables de les activer dans le micro-environnement tumoral ou, dans ces conditions, les CDps pourraient participer à l’immunosuppression tumorale, qui pourrait résulter de l’interaction des CDps avec d’autres cellules immunosuppressives présentes dans la tumeur. Cependant, il ne semble pas que les CDps intra-tumorales soient fonctionnellement inhibées puisque ces cellules produisent de fortes quantités d’IFN de type I après une stimulation par le CpG après leur purification. Néanmoins, nous ne savons pas si ces cellules ont cette capacité dans l’environnement tumoral. Il serait intéressant d’analyser l’effet d’une injection de CpG intra- tumorale sur la croissance de la tumeur afin de déterminer si il est possible d’activer les CDps
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Les résultats présentés dans ce mémoire montrent que les CDps sont recrutées au sein de la tumeur B16-OVA et que leur profil d’activation évolue durant la croissance tumorale. Nous avons également montré que les CDps intra-tumorales sont capables de produire de fortes quantités d’IFN de type I, in vitro, après stimulation par un ligand de TLR9.
Nos observations nous amènent à supposer que les CDps pourraient participer à la réponse immunitaire anti-tumorale à des stades précoces du développement de la tumeur. Une des stratégies permettant de déterminer le rôle des CDps intra-tumorales est d’analyser la croissance de la tumeur en absence de CDps. Sawant et al ont montré que la déplétion des CDps inhibe le développement de métastases osseuses dans un modèle murin de cancer du sein, ainsi que la dissémination de celles-ci dans le poumon (Sawant et al., 2012). Un modèle murin dépourvu en CDps a été récemment développé par notre équipe, le modèle Ikaros (Guillerey et al., 2012). Nous envisageons d’étudier la croissance de la tumeur B16-OVA dans ce modèle pour voir si l’absence de CDps serait favorable ou défavorable à la croissance tumorale.
D’autre part, les données obtenues suggèrent que les CDps pourraient jouer un rôle régulateur et être impliquées dans le microenvironnement tumoral immunosuppresseur. Nous envisageons donc d’étudier le recrutement des Tregs au sein de la tumeur B16-OVA. Nous allons également mettre en œuvre des expériences permettant d’analyser l’interaction entre les CDps intra-tumorales, purifiées à différents stades du développement tumoral, et les différentes populations de lymphocytes T (CD4+ et CD8+) pour déterminer les mécanismes
impliqués dans la régulation de la réponse immunitaire par ces cellules. Leur capacité à présenter des Ag tumoraux et à induire des réponses T sera aussi analysée. Enfin, nous prévoyons de quantifier par PCR quantitative l’expression de l’IDO par les CDps intra- tumorales purifiés. Ces expériences vont sans doute nécessiter de nouvelles mises au point dues aux probables difficultés de purification des CDps à des stades précoces (petit nombre de cellules, rendement, pureté).
Les objectifs, à terme, seraient i) de définir la fonctionnalité, et en particulier la production d’IFN de type I par les CDps intra tumoraux in vivo au cours de la croissance tumorale et ii)
Bien que dans l’ensemble, ces résultats soient préliminaires, cette étude confirme que les CDps montrent un profil intéressant pour l’élaboration de protocoles d’immunothérapie contre les tumeurs. Dans le laboratoire, nous avons récemment développé un candidat vaccin basé sur l’adenylate cyclase de Bordetella pertussis et montré sa capacité à induire une réponse Th1 des lymphocytes CD4+ d’une part et une réponse cytotoxique efficace d’autre
part (Dadaglio et al., 2000; Fayolle et al., 1999; Ladant and Ullmann, 1999). Néanmoins ce vaccin perd en efficacité à des stades tardifs de la croissance antitumorale (Berraondo et al., 2007). Nous déterminerons si les CDps sont impliquées dans la perte de cette efficacité. Une meilleure compréhension du rôle des CDps dans l’induction des réponses induites par le vaccin et des mécanismes impliqués pourrait permettre une amélioration de ce vaccin.
Cibler les CDps, avec des ligands qui leur sont propres, peut être une nouvelle stratégie de traitement et/ou venir en complément des traitements anti-tumoraux actuels (chimiothérapie, radiothérapie) pour en augmenter l’efficacité et en diminuer les doses et donc les effets secondaires.
Bibliographie
Adams, J.M., and Cory, S. (2007). The Bcl-2 apoptotic switch in cancer development and therapy. Oncogene 26, 1324-1337.
Artandi, S.E., and DePinho, R.A. (2010). Telomeres and telomerase in cancer. Carcinogenesis
31, 9-18.
Banchereau, J., and Steinman, R.M. (1998). Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392, 245-252.
Basset, C., Holton, J., O'Mahony, R., and Roitt, I. (2003). Innate immunity and pathogen-host interaction. Vaccine 21 Suppl 2, S12-23.
Bekeredjian-Ding, I., Schafer, M., Hartmann, E., Pries, R., Parcina, M., Schneider, P., Giese, T., Endres, S., Wollenberg, B., and Hartmann, G. (2009). Tumour-derived prostaglandin E and transforming growth factor-beta synergize to inhibit plasmacytoid dendritic cell-derived interferon-alpha. Immunology 128, 439-450.
Bernal, M., Ruiz-Cabello, F., Concha, A., Paschen, A., and Garrido, F. (2012). Implication of the beta2-microglobulin gene in the generation of tumor escape phenotypes. Cancer Immunol Immunother 61, 1359-1371.
Berraondo, P., Nouze, C., Preville, X., Ladant, D., and Leclerc, C. (2007). Eradication of large tumors in mice by a tritherapy targeting the innate, adaptive, and regulatory components of the immune system. Cancer Res 67, 8847-8855.
Beutler, B. (2004). Innate immunity: an overview. Mol Immunol 40, 845-859.
Beyer, M., and Schultze, J.L. (2006). Regulatory T cells in cancer. Blood 108, 804-811. Biron, C.A., Nguyen, K.B., Pien, G.C., Cousens, L.P., and Salazar-Mather, T.P. (1999). Natural killer cells in antiviral defense: function and regulation by innate cytokines. Annu Rev Immunol 17, 189-220.
Blasco, M.A. (2005). Telomeres and human disease: ageing, cancer and beyond. Nature reviews Genetics 6, 611-622.
Blasius, A.L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., and Colonna, M. (2006). Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12. Blood 107, 2474- 2476.
Boon, T., and Old, L.J. (1997). Cancer Tumor antigens. Curr Opin Immunol 9, 681-683. Boshoff, C., and Weiss, R. (2002). AIDS-related malignancies. Nat Rev Cancer 2, 373-382. Brinkmann, V., Reichard, U., Goosmann, C., Fauler, B., Uhlemann, Y., Weiss, D.S., Weinrauch, Y., and Zychlinsky, A. (2004). Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science 303, 1532-1535.
Bronte, V., Chappell, D.B., Apolloni, E., Cabrelle, A., Wang, M., Hwu, P., and Restifo, N.P. (1999). Unopposed production of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by tumors inhibits CD8+ T cell responses by dysregulating antigen-presenting cell maturation. J Immunol 162, 5728-5737.
Burnet, M. (1957). Cancer; a biological approach. I. The processes of control. Br Med J 1, 779-786.
Chaperot, L., Blum, A., Manches, O., Lui, G., Angel, J., Molens, J.P., and Plumas, J. (2006). Virus or TLR agonists induce TRAIL-mediated cytotoxic activity of plasmacytoid dendritic cells. J Immunol 176, 248-255.
Chaplin, D.D. (2010). Overview of the immune response. J Allergy Clin Immunol 125, S3-23. Clemente, C.G., Mihm, M.C., Jr., Bufalino, R., Zurrida, S., Collini, P., and Cascinelli, N. (1996). Prognostic value of tumor infiltrating lymphocytes in the vertical growth phase of primary cutaneous melanoma. Cancer 77, 1303-1310.
Colonna, M., Trinchieri, G., and Liu, Y.J. (2004). Plasmacytoid dendritic cells in immunity. Nat Immunol 5, 1219-1226.
Colotta, F., Allavena, P., Sica, A., Garlanda, C., and Mantovani, A. (2009). Cancer-related inflammation, the seventh hallmark of cancer: links to genetic instability. Carcinogenesis 30, 1073-1081.
Conrad, C., Gregorio, J., Wang, Y.H., Ito, T., Meller, S., Hanabuchi, S., Anderson, S., Atkinson, N., Ramirez, P.T., Liu, Y.J., et al. (2012). Plasmacytoid dendritic cells promote immunosuppression in ovarian cancer via ICOS costimulation of Foxp3(+) T-regulatory cells. Cancer Res 72, 5240-5249.
Dadaglio, G., Moukrim, Z., Lo-Man, R., Sheshko, V., Sebo, P., and Leclerc, C. (2000). Induction of a polarized Th1 response by insertion of multiple copies of a viral T-cell epitope into adenylate cyclase of Bordetella pertussis. Infect Immun 68, 3867-3872.
De Palma, M., and Lewis, C.E. (2013). Macrophage regulation of tumor responses to anticancer therapies. Cancer Cell 23, 277-286.
Diefenbach, A., Jensen, E.R., Jamieson, A.M., and Raulet, D.H. (2001). Rae1 and H60 ligands of the NKG2D receptor stimulate tumour immunity. Nature 413, 165-171.
Drobits, B., Holcmann, M., Amberg, N., Swiecki, M., Grundtner, R., Hammer, M., Colonna, M., and Sibilia, M. (2012). Imiquimod clears tumors in mice independent of adaptive immunity by converting pDCs into tumor-killing effector cells. J Clin Invest 122, 575-585. Dunn, G.P., Bruce, A.T., Ikeda, H., Old, L.J., and Schreiber, R.D. (2002). Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol 3, 991-998.
Dunn, G.P., Sheehan, K.C., Old, L.J., and Schreiber, R.D. (2005). IFN unresponsiveness in LNCaP cells due to the lack of JAK1 gene expression. Cancer Res 65, 3447-3453.
Epstein, N.A. (1976). Prostatic carcinoma. Correlation of histologic features of prognostic value with cytomorphology. Cancer 38, 2071-2077.
Evan, G., and Littlewood, T. (1998). A matter of life and cell death. Science 281, 1317-1322. Faget, J., Bendriss-Vermare, N., Gobert, M., Durand, I., Olive, D., Biota, C., Bachelot, T., Treilleux, I., Goddard-Leon, S., Lavergne, E., et al. (2012). ICOS-ligand expression on plasmacytoid dendritic cells supports breast cancer progression by promoting the accumulation of immunosuppressive CD4+ T cells. Cancer Res 72, 6130-6141.
Fallarino, F., Asselin-Paturel, C., Vacca, C., Bianchi, R., Gizzi, S., Fioretti, M.C., Trinchieri, G., Grohmann, U., and Puccetti, P. (2004). Murine plasmacytoid dendritic cells initiate the immunosuppressive pathway of tryptophan catabolism in response to CD200 receptor engagement. J Immunol 173, 3748-3754.
Fayolle, C., Ladant, D., Karimova, G., Ullmann, A., and Leclerc, C. (1999). Therapy of