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Étude du recrutement et de l’activation des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans un modèle de tumeur murin

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Academic year: 2021

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Texte intégral

(1)

HAL Id: dumas-01699290

https://dumas.ccsd.cnrs.fr/dumas-01699290

Submitted on 2 Feb 2018

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Étude du recrutement et de l’activation des cellules

dendritiques plasmacytoïdes dans un modèle de tumeur

murin

Marine Oberkampf de Dabrun

To cite this version:

Marine Oberkampf de Dabrun. Étude du recrutement et de l’activation des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans un modèle de tumeur murin. Cancer. 2014. �dumas-01699290�

(2)

CONSERVATOIRE NATIONAL DES ARTS ET METIERS

PARIS

Mémoire

présenté en vue de l’obtention

du DIPLOME d’INGENIEUR CNAM

Spécialité : Sciences et techniques du vivant

Option : génie biologique

par

Marine OBERKAMPF de DABRUN

Etude du recrutement et de l’activation

des cellules dendritiques plasmacytoïdes

dans un modèle de tumeur murin

soutenu le 18 décembre 2014

Jury

PRESIDENT : Pr. Philippe POCHART

MEMBRES :

Dr. Nathalie BENDRISS-VERMARE

M. Erwan CORCUFF

Dr. Olivier HENNEBERT

Dr. Gilles DADAGLIO

(3)

Remerciements  

En préambule à ce mémoire, je souhaite adresser mes remerciements les plus sincères aux personnes qui m'ont apporté leur aide et qui ont contribué à l’aboutissement de toutes ces années au CNAM et à l'élaboration de ce mémoire.

Je tiens tout d’abord à remercier les membres du jury. Merci au Pr. Philippe Pochart qui a accepté de prendre la relève en tant que tuteur. Merci au Dr. Olivier Hennebert pour ses cours particulièrement passionnants. Merci également au Dr Nathalie Bendriss-Vermare et à Mr Erwan Corcuff qui ont accepté d’être membres du jury, il y a plus d’un an.

Je remercie chaleureusement le Pr. Claude Leclerc qui m’a toujours soutenue dans ma démarche et qui m’a permis de réaliser ce projet personnel. Merci pour la confiance qu’elle m’a accordée dès mon arrivée dans l’unité.

Un grand merci au Dr. Gilles Dadaglio qui s'est toujours montré à l'écoute et disponible tout au long de cette étude. Merci pour ses nombreux conseils, le temps qu'il m’a consacré et pour les nombreuses relectures de ce mémoire.

Je remercie vivement les enseignants de la chaire de biologie du CNAM, notamment le Dr. Marie-Irène Malewiak pour ses précieux conseils en début de stage.

Je remercie l’ensemble de mes collègues, anciens ou actuels, de l’unité Régulation Immunitaire et Vaccinologie. Merci à Ming pour m’avoir transmis son expertise en cytométrie. Merci à Camille pour nos discussions « pDC » et personnelles, pour nos restos entre filles en cas de rédaction tardive. Merci à Laleh pour ses conseils scientifiques ainsi que pour nos soirées Mojitos passées et futures. Un grand merci à Nada, pour sa bonne humeur communicative, son écoute et son amitié. Merci spécial à « mes copines » : Daphné, ma voisine de bureau, pour son soutien quotidien, ses conseils avisés pour l’analyse de mes résultats, son aide pour trouver les mots justes, nos fous-rires… et Edith, pour ses encouragements constants et son réconfort dans les moments de démotivation. Merci à Sébastien qui m’a notamment aidée, de façon très pédagogique, à mettre mes idées en place

(4)

membres du laboratoire pour leurs encouragements, je suis heureuse de faire partie de cette équipe.

Je tiens à remercier mes compagnons de galère du CNAM… Merci notamment à Frédérique, avec qui j’ai commencé les cours du soir, il y a 8 ans. C’est toujours plus motivant d’être 2 à aller suivre des cours après une journée de travail.

Un grand merci à Aude, Gaëlle et Malika, amies pasteuriennes, pour leur écoute et leurs encouragements durant toutes ses années. Merci aussi aux anciens collègues pour leur soutien.

J'adresse mes plus sincères remerciements à tous mes proches et amis, qui m'ont toujours soutenue et encouragée au cours de ses années, à des moments plus ou moins faciles de ma vie. Un immense merci à Anne et Céline qui savent toujours comment me réconforter dans les moments difficiles. Merci aussi à mes chères « brunettes ».

Merci à mes 4 sœurs, à mes grands-parents, à Bertrand et Béatrice pour leur accompagnement et leurs encouragements.

Enfin, je remercie mes parents, à qui je n’ai pas rendu la tache facile en me lançant dans des études scientifiques. Merci de m’avoir soutenu et m’avoir transmis cette force de caractère qui m’a permis d’arriver là où j’en suis.

Je tiens à dédicacer ce mémoire à mon père qui continue à me suivre de là-haut et à Fanny, partie trop tôt, à cause de ce foutu cancer…

(5)

Table  des  matières  

Abstract  ...  7  

Table  des  illustrations  ...  8  

Liste  des  abréviations  ...  11  

INTRODUCTION  GENERALE  ...  13  

INTRODUCTION  BIBLIOGRAPHIQUE  ...  14  

I.   Le  cancer  ...  14  

I-­‐A.  Généralités  ...  14  

I-­‐B.  Les  caractéristiques  du  cancer  ...  15  

II.   Immunité  ...  17  

II-­‐A.  Immunité  innée  ...  18  

II-­‐A-­‐1.  Molécules  solubles  et  récepteurs  membranaires  ...  18  

II-­‐A-­‐2.  Cellules  de  l’immunité  innée  ...  21  

a)  Les  Neutrophiles  ...  21  

b)  Eosinophiles  et  basophiles  ...  21  

c)  Les  macrophages  ...  21  

d)  Les  cellules  tueuses  naturelles  ou  cellules  NK  (pour  l’anglais  «  Natural  Killer  »)  ...  22  

e)  Les  cellules  dendritiques  ...  22  

II-­‐A-­‐3.  Interactions  entre  immunités  innée  et  adaptative  ...  24  

II-­‐B.  Immunité  adaptative  ...  24  

II-­‐B-­‐1.  Cellules  de  l’immunité  adaptative  ...  25  

a)  Lymphocytes  B  ...  25  

b)  Lymphocytes  T  ...  25  

II-­‐B-­‐2.  Tolérance  centrale  et  périphérique  ...  28  

III.   Le  cancer  face  à  l’immunité  ...  28  

III-­‐A.  Généralités  ...  28  

III-­‐B.  Le  cancer  :  «  soi  »  ou  «  non  soi  »  ?  ...  29  

III-­‐C.  Théorie  des  3  E  et  concept  d’«  Immuno  editing  »  ...  30  

III-­‐C-­‐1.  Immuno-­‐surveillance  ou  phase  d’élimination  ...  32  

III-­‐C-­‐2.  Phase  d’équilibre  puis  phase  d’échappement  ...  33  

III-­‐C-­‐3.  Modifications  des  cellules  tumorales  pour  échapper  à  la  réponse  immunitaire.  ...  33  

a)  Présentation  de  l’antigène  ...  33  

b)  Autres  mécanismes  ...  34  

III-­‐C-­‐4.  Le  micro-­‐environnement  tumoral.  ...  34  

(6)

d)  Cellules  dendritiques  (CDs)  ...  37  

IV.   Les  cellules  dendritiques  plasmacytoïdes  (CDps)  ...  38  

IV-­‐A.  Caractéristiques  ...  38  

IV-­‐B.  CDps  et  réponses  immunitaires  ...  39  

IV-­‐B-­‐1.  Les  CDps  :  lien  entre  réponses  innée  et  adaptative  ...  39  

a)  CDps  et  réponse  innée  ...  40  

b)  CDps  et  réponse  adaptative  ...  40  

c)  CDps  :  Cellules  présentatrices  d’antigènes  ...  40  

IV-­‐B-­‐2.  CDps  et  pathologies  ...  41  

IV-­‐B-­‐3.  CDps  immatures  et  tolérance  ...  42  

a)  Les  CDps  immatures  inhibent  la  réponse  T  ...  42  

b)  CDps  et  Tregs  ...  43  

c)  CDps  et  tolérance  orale  ...  43  

IV-­‐B-­‐4.  Les  CDps  dans  les  tumeurs.  ...  43  

a)  Migration  des  CDps  vers  la  tumeur  ...  43  

b)  Rôle  des  CDps  dans  l’inhibition  de  la  réponse  immunitaire  anti-­‐tumorale.  ...  44  

c)  Les  CDps  activées  peuvent  induire  une  réponse  immunitaire  anti-­‐tumorale  ...  44  

OBJECTIFS  ...  47  

MATERIELS  ET  METHODES  ...  48  

I.   Techniques  et  appareils  ...  48  

I-­‐A.  La  cytométrie  en  flux.  ...  48  

I-­‐A-­‐1.  Principe.  ...  48  

I-­‐A-­‐2.  Le  tri  ...  49  

I-­‐A-­‐3.  Analyse  des  données  et  compensations  ...  50  

I-­‐B.  AutoMACS  Pro  Separator®  (Miltenyi  Biotec)  ...  51  

I-­‐C.  ELISA  ...  52  

I-­‐D.  Technologie  Luminex®  ...  53  

II.   Matériels  ...  54  

II-­‐A.  Modèle  animal  et  lignée  cellulaire  ...  54  

II-­‐  B.  Anticorps  et  billes  magnétiques  ...  55  

III.   Méthodes  ...  56  

III-­‐A.  Préparation  des  suspensions  cellulaires  pour  le  phénotypage  ...  56  

III-­‐B.  Marquage.  ...  56  

III-­‐C.  Enrichissement  en  cellules  dendritiques  plasmacytoïdes  et  tri  ...  57  

III-­‐D.  Mise  en  culture  ...  57  

III-­‐E.  Quantification  des  cytokines  ...  58  

(7)

RESULTATS  ...  59  

I.   Mise  au  point  des  protocoles  expérimentaux.  ...  59  

I-­‐A.  Mise  au  point  du  protocole  pour  l’analyse  phénotypique  des  CDps  intra-­‐tumorales  sur   LSR  Fortessa  ...  59  

I-­‐A-­‐1.  Problématique.  ...  59  

I-­‐A-­‐2.  Choix  de  la  stratégie  de  discrimination  des  CDps  ...  60  

a)  Premier  test  ...  60  

b)  Second  et  troisième  tests  ...  61  

c)  Quatrième  test  ...  63  

I-­‐A-­‐3.  Composition  finale  des  panels  d’anticorps  ...  64  

I-­‐B.  Mise  au  point  du  protocole  pour  la  purification  des  CDps  intra-­‐tumorales.  ...  67  

I-­‐B-­‐1.  Objectifs  ...  67  

I-­‐B-­‐2.  Enrichissement  par  tri  magnétique  (Automacs  Pro  Separator)  ...  67  

I-­‐B-­‐3.  Tri  par  cytométrie  en  flux  (Aria  III)  ...  67  

I-­‐B-­‐4.  Premiers  essais  de  purification  des  CDps  ...  68  

I-­‐B-­‐5.  Evolution  du  protocole  ...  71  

II.   Résultats  ...  73  

II-­‐A.  Etude  du  recrutement  des  CDps  au  cours  du  développement  d’une  tumeur.  ...  73  

II-­‐A-­‐1.  Etude  du  recrutement  des  CDps  dans  la  rate,  le  ganglion  drainant  et  la  tumeur.  ...  74  

II-­‐A-­‐2.  Analyse  phénotypique  des  CDps  lors  du  développement  de  la  tumeur.  ...  76  

a)  Marqueurs  spécifiques  des  CDps.  ...  76  

b)  Marqueurs  d’activation  ...  77  

c)  Marqueurs  d’interactions  avec  les  lymphocytes  T.  ...  81  

II-­‐A-­‐3.  Conclusions  ...  83  

II-­‐B.  Analyse  fonctionnelle  des  CDps  de  l’environnement  tumoral.  ...  84  

II-­‐B-­‐1.  Dosage  des  interférons  de  type  I  ...  85  

II-­‐B-­‐2.  Dosages  d’un  panel  de  cytokines  et  chimiokines  par  Luminex  ...  86  

a)  Cytokines  ...  86  

b)  Chimiokines  ...  87  

II-­‐B-­‐3.  Conclusions  ...  88  

DISCUSSION  ...  89  

CONCLUSION  ET  PERSPECTIVES  ...  94  

Bibliographie  ...  96  

(8)

Abstract  

The dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells essential for the induction and regulation of immune responses. Among different DCs populations, the plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are characterized by their ability to produce rapidly large amounts of type I IFN in response to stimulation by microbial or "self" RNA or DNA respectively recognized by the endosomal receptors TLR7 and TLR9. In human, pDCs are found in solid tumors and their presence is usually associated with a poor prognosis. However, the role of these cells in tumor development and anti tumoral response remains unknown.

This work aims to define the phenotype and functionality of pDCs in immunocompetent mice developing tumors. For this purpose, we used the murine tumor model of melanoma, B16-OVA, expressing ovalbumin. We first analysed the recruitment and activation status of pDCs in different lymphoid organs and in the tumor at different stages of tumor growth. We then developed protocol of purification of intratumoral pDCs to investigate their functionality in vitro.

We demonstrated that pDCs are recruited into the tumor B16-OVA during tumor growth and their activation profile varies. At early stage, pDCs show a slightly activated profile, whereas at later stages of tumor development, these cells exhibit an un-activated phenotype. These cells keep the ability to produce high amount of type I IFN and a panel of cytokines in response to in vitro stimulation with a TLR9 ligand.

In conclusion, this study suggests that pDCs could participate in the anti-tumor immune response during the development of B16-OVA. Altogether, these data suggest that pDCs could constitute an important target in the development of immunotherapy protocols against cancer.

(9)

Table  des  illustrations  

I.

Figures

Figure 1 Les caractéristiques du cancer d’après Hanahan 2011 ... 15  

Figure 2. La différenciation des lymphocytes T auxiliaires et leur rôle dans la réponse immunitaire (d’après Février 2011). ... 27  

Figure 3. Les trois phases de la théorie des 3 E. ... 31  

Figure 4. Le microenvironnement tumoral (Kerkar, 2012). ... 35  

Figure 5. Morphologie des CDps en microscopie électronique (Colonna, 2004). ... 39  

Figure 6. Rôle des CDps dans les pathologies humaines (Lande et Gilliet, 2010) ... 41  

Figure 7. Les CDps au sein du microenvironnement tumoral (Pinto, 2012). ... 45  

Figure 8. Principe d’un cytomètre en flux. ... 48  

Figure 9. Principe d’un trieur couplé à un cytomètre en flux. ... 49  

Figure 10. Schéma de la zone d’interrogation de l’ARIA III (BD). ... 50  

Figure 11 Exemple de choix de fluorochromes nécessitant une compensation de signal. réalisée par le SpectrumViewer BD. ... 51  

Figure 12. Analyse de billes marquées par un anticorps couplé au PB. ... 51  

Figure 13. Principe simplifié de séparation de l’Automacs Pro Separator (Miltenyi Biotec) . 52   Figure 14. Principe simplifié de la technologie Luminex pour un dosage immunologique. ... 54  

Figure 15. Stratégie de sélection des cellules dendritiques sur une rate naïve. ... 66  

Figure 16. Stratégie de sélection des cellules dendritiques sur une tumeur. ... 66  

Figure 17. Résultats obtenus après enrichissement par sélection positive de PDCA1 sur Automacs Pro Separator, programme Posseld2. ... 69  

Figure 18. Fractions de CDps obtenues après tri par cytométrie en flux, à partir de suspensions cellulaires enrichies en CDps par l’Automacs Pro Separator, programme Posseld2. ... 70  

Figure 19. Composition de la suspension de cellules tumorales obtenue par enrichissement à l’Automacs Pro Separator, programme Possels et stratégie de tri à l’Aria III. ... 72  

Figure 20. Fractions de CDps obtenues après tri par cytométrie en flux, à partir des suspensions cellulaires enrichies en CDps par l’Automacs Pro Separator, programme Possel_s. ... 73  

(10)

Figure 22. Étude du recrutement des CDps et CDcs dans la rate, le ganglion drainant la tumeur et le tissu tumoral de souris développant une tumeur B16-OVA. ... 75   Figure 23. Moyennes d’intensité de fluorescence obtenues par cytométrie en flux pour les marqueurs spécifiques Ly6C, SiglecH, PDCA1 et B220 pour les CDps et les CDcs ... 76   Figure 24. Moyennes d’intensité de fluorescence obtenues par cytométrie en flux pour les marqueurs d’activation CD69, CD80, PDCTrem, CD86, et les molécules du CMH pour les CDps et CDcs spléniques au cours du développement de la tumeur. ... 77   Figure 25. Moyennes d’intensité de fluorescence obtenues par cytométrie en flux pour les marqueurs d’activation CD69, CD80, PDCTrem, CD86, et molécules du CMH pour les CDps et les CDcs du ganglion drainant la tumeur au cours du développement de celle-ci. ... 79   Figure 26. Moyennes d’intensité de fluorescence obtenues par cytométrie en flux pour les marqueurs d’activation CD69, CD80, PDCTrem, CD86, et molécules du CMH pour les CDps et les CDcs intra-tumorales au cours du développement de la tumeur. ... 80   Figure 27. Moyennes d’intensité de fluorescence obtenues par cytométrie en flux pour les marqueurs d’interaction ICOSL, OX40L et PDL1 pour les CDps et les CDcs spléniques au cours du développement de la tumeur. ... 81   Figure 28. Moyennes d’intensité de fluorescence obtenues par cytométrie en flux pour les marqueurs d’interaction ICOSL, OX40L et PDL1 pour les CDps et les CDcs du ganglion drainant la tumeur au cours du développement de celle-ci. ... 82   Figure 29. Moyennes d’intensité de fluorescence obtenues par cytométrie en flux pour les marqueurs d’interaction ICOSL, OX40L et PDL1 pour les CDps et les CDcs intra-tumorales au cours du développement la tumeur. ... 83   Figure 30. Dosage de l’IFNα des surnageants de culture des CDps purifiées ... 85   Figure 31. Dosage des cytokines TNFα et IL12p40 dans les surnageants de culture par la technologie Luminex. ... 86   Figure 32. Dosages des chimiokines CCL3 et CCL4 dans les surnageants de culture par la technologie Luminex. ... 87  

II. Tableaux

Tableau 1. Les PRRs ... 19   Tableau 2. Les TLRs humains et murins ... 20   Tableau 3. Phénotype des cellules dendritiques spléniques murines. ... 23  

(11)

Tableau 4. Paramètres établis par défaut par BD sur l’Aria III. ... 50  

Tableau 5. Panels d’anticorps utilisés pour le 1er test. ... 61  

Tableau 6. Panels d’anticorps utilisés pour les 2ème et 3ème tests. ... 62  

Tableau 7. Panels d’anticorps utilisés pour le 4ème test. ... 64  

Tableau 8. Panels d’anticorps utilisés pour l’analyse phénotypique des CDps. ... 65  

Tableau 9. Panel d’anticorps pour le tri à l’Aria III ... 67  

Tableau 10. Fréquences de CDps obtenues à partir des différents organes après enrichissement par passage sur Automacs programme Posseld2. ... 69  

Tableau 11. Fréquences de CDps obtenues par organe après enrichissement par Automacs programme Possels. ... 72

(12)

Liste  des  abréviations  

ADN   Acide  désoxyribonucléique  

ARN   Acide  ribonucléique  

ARNm   ARN  messager  

   

BCR   "B  cell  receptor"  

BDCA   "Blood  dendritic  cell  antigen"  

    CCL   "CC  Chemokine  Ligand"   CCR   "CC  Chemokine  receptor"   CD   Cellule  dendritique   CDc   CD  conventionnelle   CDp   CD  dendritique  

CLR   "C  type  Lectine  Receptor"  

CMH   Complexe  majeur  d'histocompatibilité  

CPA   Cellule  présentatrice  d'antigène  

CTLA4   "Cytotoxic  T-­‐lymphocyte-­‐associated  protein  4"  

CXCL   "CXC  Chemokine  Ligand"  

CXCR   "CXC  Chemokine  receptor"  

CY   cascade  yellow  

   

DO   Densité  optique  

   

EDTA   Ethylène  diamine  tetra  acétique  

ELISA   "Enzyme-­‐linked  immunosorbent  assay"  

   

FSC   "Forward  scatter"  

   

GM-­‐CSF   "Granulocyte-­‐macrophage  colony-­‐stimulating  factor"  

   

HRP   "Horseradish  peroxidase"  

   

ICOS   "Inducible  costimulator"  

IDO   Indoléamine  2-­‐3-­‐dioxygénase  

Ig   Immunoglobuline  

IL   Interleukine  

ILC   "Innate  lymphoïd  cell"  

iNOS   "Inducible  nitric  oxide  synthase"  

IRF   "IFN  regulatory  factor"  

   

LB   Lymphocyte  B  

LKB1   "Liver  kinase  B1"  

LPS   Lipopolysaccharide  

   

MAGE   "Melanoma-­‐associated  antigen"  

MCA   methylcholranthrene  

MDSC   "Myeloïd  derived  suppressive  cell"  

MFI   "Mean  fluorescence  intensity"  

MMR   "Mannose  macrophage  receptor"  

(13)

NC   Nano  cristaux  

NCR   "Natural  cytotoxicity  receptors"  

NET   "Neutrophile  extracellular  trap"  

NK   "Natural  Killer"  

NKG2D   "Natural-­‐killer  group  2,  member  D"  

NLR   NOD  like  Receptor  

NO   oxyde  nitrique  

   

PAMP   "Pathogen-­‐associated  molecular  pattern"  

PB   "pacific  blue"  

PBS   "Phosphate  buffered  saline"  

PCR   "Polymerase  chain  reaction"  

PD1   "Programmed  cell  death  1"  

PE   phycoérythrine  

PGE2   Prostaglandine  E2  

PRR   "Pattern  Recognition  Receptor"  

   

Rag   "Recombination-­‐activating  gene"  

RLR   "RIG  like  receptor"  

RNS   "Reactive  nitrogen  species"  

ROS   "Reactive  oxygen  species"  

RSV   "Respiratory  Syncytial  Virus"  

   

SIDA   symptome  d'immudéficience  acquise  

SSC   "Side  Scatter"  

SVF   Sérum  de  veau  fétal  

   

TAA   "Tumor  associated  antigen"  

TAM   "Tumor  associated  macrophage"  

TCR   T  cell  récepteur"  

TGF   "Transforming  growth  factor"  

Th   T  "helper"  

TIRAP   "Toll-­‐interleukin  1  receptor  (TIR)  domain  containing  adaptor  protein"  

TLR   "Toll  like  receptor"  

TMB   3,  3',  5,  5'  -­‐  Tetramethylbenzidine  

TNF   "Tumor  necrosis  factor"  

TRAIL   "Tumor-­‐necrosis-­‐factor  related  apoptosis  inducing  ligand"  

TRAM   "Toll-­‐like  receptor  4  adaptor  protein"  

Treg   T  régulateur  

TRIF   "TIR-­‐domain-­‐containing  adapter-­‐inducing  interferon-­‐β"  

   

(14)

INTRODUCTION  GENERALE  

Depuis 2004, le cancer est devenu la 1ère cause de mortalité chez l'adulte en France, devant les maladies cardio-vasculaires. Le cancer survient à partir d’une cellule normale altérée par un certain nombre de mutations qui ne sont pas réparées par les processus normalement utilisés par la cellule. La cellule tumorale prolifère de façon anormale et, si elle n’est pas détruite, se multiplie pour former une tumeur.

Les cellules transformées sont généralement reconnues et détruites par le système immunitaire selon la théorie de l’immunosurveillance. Les tumeurs utilisent cependant de nombreux mécanismes d’échappement, comme le masquage de leurs antigènes tumoraux, la production de facteurs immunosuppressifs et dans certains cas le détournement des cellules de l’immunité à leur profit (Colonna et al., 2004; Vesely et al., 2011).

Parmi ces mécanismes d’échappement, plusieurs études suggèrent que les cellules dendritiques plasmacytoïdes (CDps) pourraient être impliquées.

Les CDps sont une population de cellules dendritiques caractérisées par leur capacité à produire de fortes quantités d’interférons de type 1 en particulier en réponse à une infection virale (Colonna et al., 2004). Les CDps se développent dans la moelle osseuse puis migrent dans les compartiments riches en lymphocytes T. Elles sont rares dans les organes périphériques et représentent 0,2 à 0,8% des cellules sanguines chez l’individu sain.

Des CDps ont été retrouvées dans plusieurs tumeurs solides humaines (Lande and Gilliet, 2010; Vermi et al., 2011) telles que les cancers de la tête et du cou, du sein, de l’ovaire, des poumons et de la peau, et sont généralement associées à un mauvais pronostic (Treilleux et al., 2004). Des études ont montré que les CDps pouvaient être associées au développement et au maintien de l’environnement immunosuppresseur de la tumeur, notamment en stimulant les lymphocytes T régulateurs.

Par ailleurs, certains traitements récents, visant à activer les CDps intra-tumorales, ont conduit à une régression de la tumeur (Hofmann et al., 2008; Liu et al., 2008; Vicari et al., 2002). Ainsi les CDps pourraient jouer un rôle dans la protection antitumorale.

Cependant, bien qu’il soit démontré que les CDps sont impliquées dans l’immunité anti-tumorale, le rôle physiologique des CDps lors du développement de la tumeur et sur son contrôle n’est toujours pas clairement établi.

(15)

INTRODUCTION  BIBLIOGRAPHIQUE  

I.

Le cancer

I-A. Généralités

Chez un adulte sain, environ 200 milliards de cellules, sur 1014 cellules au total,

meurent et naissent tous les jours. Au moment de chaque division, il arrive parfois que les enzymes responsables de la réplication de l’ADN fassent des erreurs générant des mutations, par exemple sous l’action des facteurs mutagènes, tels que les radiations UV, le tabac ou certaines infections virales. La cellule est dotée de plusieurs mécanismes de contrôle permettant soit la réparation de l’erreur, soit le cas échéant, la mort programmée par les mécanismes d’apoptose. Quand une cellule mutée échappe à ces mécanismes de contrôle, la mutation est transmise aux cellules filles. Certaines mutations affectant les mécanismes de la prolifération cellulaire conduisent à la multiplication incontrôlée de ces cellules. Ainsi, une cellule devient tumorale en plusieurs étapes impliquant plusieurs mutations successives qui confèrent progressivement à la cellule un état pré-cancéreux puis cancéreux.

Il existe plusieurs types de cancers classés en fonction de la nature du tissu dans lequel il se développe. Ainsi on distingue : i) les carcinomes, où la tumeur apparaît dans un tissu de revêtement des surfaces internes ou externes que sont les épithéliums (peau, muqueuses, glandes), ii) les sarcomes, où les cellules cancéreuses se développent dans un tissu de support comme les os, la graisse ou les muscles, et iii) les cancers hématopoïétiques quand le cancer atteint les cellules circulantes.

Aujourd’hui, un homme sur deux et une femme sur trois se verra diagnostiquer un cancer avant 85 ans. Les quatre principaux cancers sont celui de la prostate chez l’homme, du sein chez la femme, ainsi que les cancers du poumon et du côlon (carcinomes). En France, chaque année, environ 320 000 personnes sont nouvellement touchées, 920 000 traitées, et 145 000 décèdent, faisant des cancers la première cause de mortalité chez l’homme devant les maladies cardiovasculaires (Source : Institut National du Cancer (INCa)).

Les traitements actuellement les plus utilisés sont la chirurgie, la radiothérapie, la chimiothérapie et l’hormonothérapie. Cependant, ces traitements sont longs, coûteux, et souvent particulièrement éprouvants pour le patient, car engendrant de nombreux effets secondaires, et malheureusement souvent trop peu efficaces. On déplore encore chaque année

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cancer de la prostate (Source : INCa). D’où l’importance de trouver de nouvelles approches thérapeutiques plus ciblées, tout en limitant la toxicité sur les tissus sains. La recherche actuelle cible donc l’environnement direct de la tumeur et tout particulièrement les systèmes immunitaire et vasculaire. Plusieurs observations chez les patients ont en effet confirmé le rôle primordial du système immunitaire dans le contrôle des cancers, et l’immunothérapie commence à se développer.

I-B. Les caractéristiques du cancer

Figure 1 Les caractéristiques du cancer d’après Hanahan 2011.

Le cancer présente plusieurs caractéristiques distinctes et complémentaires qui permettent la croissance tumorale et l’invasion métastatique, et fournissent une base solide pour la compréhension de la biologie de cette maladie. Hanahan et al. en décrivent huit principales dont deux ont émergé des récents résultats et observations (Fig. 1) (Hanahan and Weinberg, 2011). L’ensemble de ces caractères est rendu possible d’une part par le développement de l’instabilité génomique des cellules cancéreuses (Negrini et al., 2010), mais aussi par l’état inflammatoire des lésions précancéreuses puis cancéreuses (Colotta et al., 2009).

La caractéristique fondamentale des cellules cancéreuses est leur autonomie de croissance. Les tissus normaux contrôlent la production et la libération des signaux de croissance qui régissent l'entrée et la progression de la cellule dans le cycle cellulaire, assurant ainsi une

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homéostasie du nombre de cellules, et donc le maintien de l'architecture et de la fonction des tissus. Les cellules tumorales peuvent produire elles-mêmes des facteurs de croissance, auxquels elles peuvent répondre par l'expression de récepteurs associés, ce qui entraîne une stimulation de prolifération autocrine (Hynes, 2000; Witsch et al., 2010).

Les cellules cancéreuses doivent également contourner les mécanismes qui régulent négativement la prolifération cellulaire : la plupart de ces programmes dépendent de protéines codées par les gènes suppresseurs de tumeurs, tels que les protéines du rétinoblastome et TP53 (Ghebranious and Sell, 1998; Lipinski and Jacks, 1999), mais aussi des voies du TGFß (Ikushima and Miyazono, 2010). Les cellules cancéreuses sont également insensibles à l’inhibition de contact, phénomène par lequel une cellule en train de croître cesse sa progression quand elle entre en contact avec une autre cellule du même type. Par exemple,

LKB1, un gène codant pour une protéine impliquée dans un des mécanismes d’inhibition de

contact et aidant à maintenir l'intégrité des tissus, est perdu dans certaines tumeurs humaines (Shaw, 2009). Ce gène a été identifié comme suppresseur de tumeur.

Une autre particularité des cellules tumorales est leur protection contre la mort programmée par apoptose. L'apoptose est le processus par lequel des cellules déclenchent leur mort, par fragmentation de la chromatine, en réponse à un signal ou à une absence de signal (Kerr et al., 1972). Ce processus permet de réguler le nombre de cellules au sein d’un tissu ou organe. Il est établi que la mort programmée des cellules par apoptose est un barrage naturel au développement du cancer. Or, il a été démontré que ce mécanisme peut être atténué au sein des tumeurs, leur permettant ainsi de proliférer, d’acquérir une forte malignité, et de résister aux traitements (Adams and Cory, 2007; Evan and Littlewood, 1998).

Un autre caractère distinctif des cellules tumorales est leur immortalité. La limitation de la division cellulaire a été associée à deux processus distincts bloquant la prolifération que sont la sénescence (définie par Hayflick en 1965), qui correspond à l’entrée dans un état non proliférant mais viable, et la crise, mort cellulaire provoquée par des anomalies chromosomiques (Maser and DePinho, 2002). Le contournement successif de ces deux mécanismes a été appelé immortalisation. Plusieurs études indiquent que les télomères, qui protègent les extrémités des chromosomes, sont au centre de la capacité de prolifération illimitée des cellules tumorales (Artandi and DePinho, 2010; Blasco, 2005; Shay and Wright, 2000). Des études sur des modèles murins déficients en télomérase ont montré que des télomères courts fonctionnent comme des suppresseurs de tumeurs puissants.

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cela, les tumeurs sont capables d’un processus d’angiogénèse permettant la génération de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de ceux déjà existants, et ce en continu (Hanahan and Folkman, 1996), alors qu’à l’âge adulte ce processus n’est activé normalement que de façon transitoire. Les conséquences principales de l’angiogénèse générée par la tumeur sont donc de permettre à celle-ci de se nourrir afin de croître. La vascularisation des tumeurs leur permet également de métastaser.

Le processus métastatique est une caractéristique majeure du cancer restée longtemps inexpliquée. Il correspond à une longue série d’étapes liées les unes aux autres. Les cellules cancéreuses se transforment en perdant les molécules qui assurent l'adhésion des cellules entre elles, pour entrer alors dans la circulation sanguine et lymphatique, jusqu’à atteindre un nouvel organe par extravasation et y développer une tumeur secondaire à plus ou moins long terme (Cavallaro and Christofori, 2004; Talmadge and Fidler, 2010).

Enfin, deux nouvelles caractéristiques des cancers ont émergé des recherches actuelles, et ont ouvert de nouvelles pistes thérapeutiques.

La première est la dérégulation du métabolisme cellulaire qui favorise la croissance et la prolifération continues des tumeurs. En effet, alors que la glycolyse est un mécanisme utilisé généralement en condition anaérobie, les cellules cancéreuses peuvent reprogrammer leur métabolisme du glucose, et donc leur production d'énergie, en limitant leur métabolisme énergétique en grande partie à la glycolyse, même en présence d’oxygène (Jones and Thompson, 2009).

La seconde, qui sera traitée dans le chapitre III, est l’échappement des cellules tumorales aux réponses du système immunitaire (Kim et al., 2007).

II. Immunité

L’immunité est l’ensemble des mécanismes de défense d’un organisme contre les éléments étrangers. La réponse immunitaire est composée de deux types de défense : l'immunité innée et l’immunité adaptative (Chaplin, 2010). L'immunité innée correspond à une réponse constitutive d'action immédiate, non spécifique de l’agent pathogène. Elle repose sur la reconnaissance de signaux de danger.

L'immunité adaptative, ou acquise, est d’action plus tardive et est spécifique de l'antigène. La réponse adaptative est limitée dans le temps à l'éradication de l'agent pathogène dont elle garde la mémoire. Elle repose sur une réponse sélective très fine face aux antigènes étrangers

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(« non-soi »). En effet les lymphocytes T et B, cellules de l’immunité adaptative, portent à leur surface des récepteurs d’antigène hautement spécifiques. Au cours de leur génération dans les organes lymphoïdes primaires, la majeure partie des cellules de l'immunité adaptative reconnaissant des antigènes du soi est éliminée.

Dans ce chapitre, seule la réponse immunitaire face à un agent extérieur sera décrite. Le cas particulier de l’immunité face au cancer sera décrit dans le chapitre suivant.

II-A. Immunité innée

L’immunité innée est la première ligne de défense de l’organisme face aux agents étrangers. Les premiers composants de celle-ci sont les barrières anatomiques telles que la peau et les muqueuses. Ces barrières ne sont pas passives. La peau produit de nombreux agents antimicrobiens et les muqueuses ont de nombreux mécanismes de défense non spécifiques, permettant d’éviter l’entrée de pathogènes dans l’organisme.

Lorsque qu’un agent étranger franchit les barrières anatomiques et physiologiques de l’hôte, l’infection ou la lésion tissulaire induisent une cascade d’événements complexes appelée réponse inflammatoire. Dans les heures qui suivent, les leucocytes sont recrutés et traversent les parois capillaires de la région enflammée. Le système immunitaire répond à l’infection grâce à deux fonctions importantes : la détection et la destruction par des mécanismes incluant des signaux spécifiques et des cellules particulières (Basset et al., 2003; Beutler, 2004).

II-A-1. Molécules solubles et récepteurs membranaires

La fonction de détection est d’abord remplie par les récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires (PRR pour l’anglais « Pattern Recognition Receptors ») qui reconnaissent des motifs conservés exprimés par les pathogènes appelés PAMPs (« Pathogen Associated Molecular Pattern »), absents chez les eucaryotes (Basset et al., 2003). La reconnaissance des PAMPs va induire la production de médiateurs solubles par les cellules de la réponse immunitaire innée. L’activation de cette dernière peut conduire à la destruction du pathogène, mais aussi à la stimulation de l’inflammation et à l’attraction des cellules de l’immunité (notamment des neutrophiles) sur le site de l’infection.

Les interactions PAMP-PRR vont déclencher la réponse inflammatoire, correspondant à la sécrétion de facteurs solubles qui permettent le recrutement de cellules au site de l’inflammation : i) les chimiokines, dont la fonction principale est l’attraction des cellules du

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que le TNF-α, et les interleukines IL-1, IL-6 et IL-12. iii) Les substances vasodilatatrices : le monoxyde d’azote (NO) et les prostanoïdes. iv) Les cytokines anti-inflammatoires : l’IL-10 et le TNF-β, jouant un rôle de régulation de la réaction inflammatoire, permettant ainsi qu’elle ne devienne exagérée et donc pathologique. L’ensemble des facteurs produits va orienter les réponses en fonction des signaux reçus, permettant à l’hôte d’adapter ses réponses.

Tableau 1. Les PRRs

Localisation Nom des récepteurs Pathogènes associés

Membranaires TLR Toll like receptor Cf Tableau 2

MMR Mannose macrophage receptor Bactéries et Virus

CLR Lectines de type C Bactéries et Virus

R du complément Bactéries et Virus

R scavengers Substances étrangères

Cytoplasmiques NLR NOD like Receptor Bactéries

RLR RIG like receptor Virus

Les PRRs (cf Tableau 1) sont exprimés par toutes les cellules de l'immunité innée. Certains de ces récepteurs sont membranaires (TLR, MMR, CLR, récepteurs du complément et scavengers), tandis que d'autres sont cytoplasmiques (NLR et RLR). De plus, certains ont une spécificité quant au type de pathogène, ce qui permet une détection efficace de celui-ci. Parmi les PRRs, seule la famille des « Toll-like » récepteurs (TLRs) sera décrite ici. Les TLRs sont des protéines transmembranaires (Iwasaki and Medzhitov, 2004) qui partagent un élément structural commun riche en leucine dans la région externe (LRR, pour Leucine-Rich Repeats). Un sous-ensemble de LRRs forme la région de fixation du ligand du TLR. Treize TLRs ont été dénombrés chez l’homme et la souris (Tableau 2) ; les trois derniers n’étant pas fonctionnels chez l’homme. Les TLRs qui reconnaissent les ligands extracellulaires sont trouvés à la surface des cellules, tandis que ceux qui reconnaissent les acides nucléiques (TLR 3, 7, 8 et 9) sont localisés dans des compartiments intracellulaires que sont les endosomes. Chacun des TLRs a une spécificité particulière qui permet de reconnaître des pathogènes différents et d’adapter la réponse immunitaire contre l’agent infectieux (Tableau 2).

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Tableau 2. Les TLRs humains et murins

TLRs Localisation cellulaire

Ligands Cibles

TLR1 Membrane cellulaire Lipopeptides triacylés Mycobactéries

TLR2 Membrane cellulaire Peptidoglycanes

Protéines liées par le GPI Lipoprotéines Zymosan Bactéries gram+ Trypanosomes Mycobactéries Levures et champignons

TLR3 Compartiment interne ARN double brin Virus

TLR4 Membrane cellulaire LPS Protéine F

Bactéries gram

-Virus respiratoire syncitial (RSV)

TLR5 Membrane cellulaire Flagelline Bactéries

TLR6 Membrane cellulaire Lipopeptides diacylés Zymosan

Mycobactéries

Levures et champignons

TLR7 Compartiment interne ARN simple brin Virus

TLR8 Compartiment interne ARN simple brin Virus

TLR9 Compartiment interne Dinucléotides non méthylés CpG et dinucléotides

Infection Herpès

ADN Bactérien

Certains virus de l’Herpès

TLR10 inconnu Bactéries (Listéria)

TLR11 (souris)

Profiline Bactéries et Parasites

TLR12 (souris)

Profiline Parasites

TLR13 (souris)

Compartiment interne ARN Bactérien Bactéries

L’interaction TLR/ligand induit un changement de conformation du récepteur qui recrute alors une, ou une combinaison, de protéine(s) adaptatrice(s) telles que MyD88, TRIF, TIRAP et TRAM. Ceci entraîne alors une cascade de signalisation qui aboutit à l’activation de facteurs de transcription (Kawai and Akira, 2011).

Diverses réactions à l’activation d’un TLR sont possibles comme la sécrétion de cytokines, la phagocytose, ou l’entrée de la cellule en apoptose et la production de composés antiviraux tels

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II-A-2. Cellules de l’immunité innée

La réponse immunitaire innée implique plusieurs types cellulaires dont les principaux sont les neutrophiles, les macrophages, les cellules NK, qui font partie des cellules lymphocytaires innées (ILC pour « Innate Lymphoïd Cells »), et les cellules dendritiques (Basset et al., 2003; Beutler, 2004).

a) Les Neutrophiles

Les neutrophiles sont essentiels pour la défense innée contre les bactéries et les champignons. Ce sont les premières cellules recrutées sur le site d’une infection. Leur principal mécanisme antimicrobien est la phagocytose. Parmi les récepteurs présents à leur surface, les neutrophiles expriment plusieurs TLRs : le TLR2 leur permet de détecter les peptidoglycanes des bactéries gram+ et le TLR4 détecte le lipopolysacharide présent dans la paroi des bactéries gram-. Cependant, ces cellules peuvent également détruire les bactéries de façon extracellulaire : Brinkmann et al ont décrit que lors de leur activation, les neutrophiles libèrent des protéines et de la chromatine qui vont former ensemble des pièges extracellulaires neutrophiles (NETs pour « Neutrophiles Extracellular Traps ») qui dégradent les facteurs de virulence (enzymes, toxines) et tuent les bactéries (Brinkmann et al., 2004). Outre ces deux mécanismes antimicrobiens, les neutrophiles en utilisent deux autres : les réponses oxydatives (ROS, RNS (reactive oxygene/nitrogen species)) et non oxydatives (BPI (bactericidal permeability-increasing protein)), protéases, lysosyme.

b) Eosinophiles et basophiles

Les éosinophiles et basophiles, nettement moins représentés que les neutrophiles, font également partie des granulocytes. Leurs granules contiennent de nombreux médiateurs inflammatoires tels que des enzymes et des espèces réactives à l’oxygène (ROS). Ces cellules sont principalement impliquées dans la réaction allergique (hypersensibilité). Les éosinophiles, capables de phagocytose, jouent un rôle dans la défense contre les parasites (Medzhitov, 2007).

c) Les macrophages

Les macrophages, cellules différenciées à partir des monocytes, ont comme les neutrophiles, une activité importante de phagocytose permettant une action directe anti-bactérienne. Les macrophages jouent un rôle de coordination des cellules du système immunitaire par la sécrétion de diverses cytokines, incluant l’IL-1, l’IL-6 et le TNF-α, et des protéines du complément (Medzhitov, 2007). De plus, ces cellules sont présentatrices

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d’antigène (CPA) c’est à dire qu’elles ont la capacité de présenter l’antigène via les molécules de classe II du Complexe Majeur d’Histocompatibilité (CMH) et sont donc aussi capables de d’induire les réponses T CD4+ et T CD8+, mais pas d’activer les lymphocytes naïfs.

Deux sous-populations distinctes de macrophages ont été décrites : les macrophages activés par la voie classique (M1) et par la voie alterne (M2) (Gordon, 2003; Sica and Mantovani, 2012). Les macrophages M1 produisent des cytokines pro-inflammatoires, des chimiokines et des molécules effectrices, telles que l'IL-12, IL-23, TNF-α et iNOS, et expriment les molécules du CMH de classe I et II. En revanche, les macrophages M2 expriment un large éventail de molécules anti-inflammatoires comme l'IL-10, le TGF-β, et l’arginase 1.

d) Les cellules tueuses naturelles ou cellules NK (pour l’anglais « Natural Killer »)

Les cellules NK sont des lymphocytes du système immunitaire inné, dénommées ainsi en raison de leur activité cytotoxique non-spécifique d’antigènes. Un ensemble de récepteurs membranaires activateurs ou inhibiteurs (NCR pour « Natural Cytotoxic Receptor ») (Moretta and Moretta, 2004) permet aux cellules NK de distinguer les cellules saines des cellules infectées (Biron et al., 1999) ou cancéreuses (Smyth et al., 2002). L’activation des cellules NK est régulée par une balance dynamique impliquant les signaux induits par les NCR activateurs et inhibiteurs. Ainsi, l’expression des molécules du CMH de classe I à la surface des cellules cibles induit un signal inhibiteur, alors que l’augmentation de l’expression de ligands du NCR NKG2D, tels que MIC A/B chez l’Homme ou H60 et Rae chez la souris, induit un signal activateur et la lyse des cellules cibles.

La lyse par les cellules NK des cellules infectées élimine ou contrôle l’infection pendant quelques jours, temps nécessaire à l’activation de la réponse adaptative. Les cellules NK jouent également un rôle crucial dans la réponse immunitaire anti-tumorale, permettant un contrôle de la croissance tumorale à des stades très précoces. Les cellules NK sont donc particulièrement impliquées dans les défenses immunitaires contre les virus et les tumeurs, mais peuvent jouer un rôle important dans la régulation des réponses immunitaires innée et adaptative, notamment en raison de leur capacité à produire de l’IFN-γ et du TNF-α qui stimule l’activité phagocytaire et bactéricide des macrophages, d’une part, et la maturation des cellules dendritiques d’autre part.

e) Les cellules dendritiques

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à-dire d’initier la réponse immunitaire spécifiquement dirigée contre les antigènes qu’elles présentent. Ces cellules sont donc un lien clé entre réponse innée et adaptative (Banchereau and Steinman, 1998; Zitvogel, 2002).

Tableau 3. Phénotype des cellules dendritiques spléniques murines.

CDc CDp CD11b+ CD8α+ CD4+ CD4 -CD11c + + + Int CD11b + + - - CD8α - - + +/- CD317 (BST-2) - - - + CMH II + + + Int CD4 + - - +/- Sirpα (CD172a) + + - -

CD24 Int Int + Int

CD205 - - + -

B220 - - - +

CD45RA - - - +

Ly6C - - - +

Siglec-H - - - +

Les CDs sont divisées en trois catégories, les CDs conventionnelles ou myéloïdes (CDcs), les CDs plasmacytoïdes (CDps) et les CDs de la peau dont les cellules de Langherans.

Ces sous-types de DC diffèrent par leur localisation, leur capacité migratoire et certaines fonctions immunologiques. Elles sont identifiées à l’aide de marqueurs de surface qui ont permis leur caractérisation. Le tableau 3 montre le phénotype des différentes sous-populations de CDs spléniques murines.

Les CDs sont très nombreuses dans tous les tissus en contact avec le milieu extérieur dans lesquels elles forment un réseau de cellules sentinelles, notamment au sein des épithéliums muqueux et dans la peau.

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En cas de signal de danger, elles peuvent atteindre rapidement la zone inflammatoire. Les CDs immatures vont alors capturer l’antigène, après interaction des PAMPS/PRRs, par phagocytose ou endocytose selon sa nature. Les CDs sont alors activées et l’expression des molécules du CMH et des molécules de co-stimulation augmente. L’antigène est alors présenté à la surface de la CD qui va migrer vers les organes lymphoïdes secondaires afin activer les réponses T.

II-A-3. Interactions entre immunités innée et adaptative

Lorsque les cellules de l’immunité détectent un signal de danger, elles produisent des chimiokines qui permettent le recrutement des cellules spécifiques (lymphocytes T et B) et des cytokines qui vont orienter leur réponse. Cependant, le principal lien entre immunité innée et adaptative sont les cellules présentatrices de l’antigène (CPA), spécifiquement les cellules dendritiques, qui jouent un rôle particulier dans l’activation de l’immunité adaptative de par leur forte capacité de migration, indispensable à l’activation des lymphocytes présents au niveau des organes lymphoïdes secondaires et leur capacité à présenter l’antigène et à activer les lymphocytes T naïfs. En fonction des cytokines libérées la réponse T sera orientée différemment. L’immunité innée va donc induire et piloter l’immunité adaptative de manière à mettre en place la réponse la plus adaptée au pathogène (Medzhitov, 2007).

Une fois la réponse adaptative mise en place, celle ci va favoriser l’action des cellules de la réponse innée. D’une part, la production d’anticorps spécifiques va faciliter la phagocytose par la fixation des anticorps aux membranes des pathogènes ou cellules infectées. Ce phénomène, décrit également avec le système du complément, est appelé opsonisation et permet une reconnaissance plus facile des pathogènes par les phagocytes (macrophages, CDs, granulocytes).

D’autre part, l’activité des macrophages va être modulée par les cytokines sécrétées par les lymphocytes T auxiliaires. Ils seront polarisés en M1, dont la capacité de phagocytose va être augmentée et aboutir à la destruction des cellules atteintes, ou en M2 qui, à l’inverse, ont une fonction d’immuno-régulation (Gordon, 2003).

II-B. Immunité adaptative

La réponse immunitaire adaptative se met en place plus tardivement mais est caractérisée par sa spécificité. Elle est médiée par les lymphocytes T et B qui possèdent un

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clonale) alors que le répertoire de l’immunité innée reste constant (Schatz et al., 1992). Enfin, une autre caractéristique de l’immunité adaptative est la génération de cellules dites « mémoires » permettant une mise en place plus rapide de la réponse lors d’une seconde infection.

II-B-1. Cellules de l’immunité adaptative

Les cellules de l’immunité adaptative sont les lymphocytes B et T. Ils sont respectivement responsables de l’immunité humorale et cellulaire (Janeway et al., 2009; Kuby et al., 2008).

a) Lymphocytes B

Les lymphocytes B représentent environ 5 à 15 % des lymphocytes circulants et sont caractérisés par les marqueurs CD19 et CD20 et par la présence d’immunoglobulines (Ig) de surface (Pieper et al., 2013). Ces immunoglobulines jouent le rôle de récepteur spécifique pour l’antigène (BCR pour « B-cell receptor »). Les lymphocytes B après activation, prolifèrent et se différencient en plasmocytes (cellules effectrices) qui sécrètent des immunoglobulines (anticorps) de la même spécificité que leur BCR. Il existe cinq classes d’immunoglobulines qui ont des fonctions effectrices différentes : les IgG, IgM, IgA, IgD et IgE. En parallèle, des lymphocytes B dits « mémoires » sont générés.

Le lymphocyte B peut jouer le rôle d’une CPA pour le lymphocyte T. Outre la reconnaissance du complexe CMH/antigène par le récepteur T, le lymphocyte B exprime des molécules de co-stimulation telles que CD80/CD86 permettant la liaison au CD28 des lymphocytes T, qui favorise l’expansion clonale et l’activation T. L’expression du CD40 Ligand (CD40L) par le lymphocyte T activé permet la liaison au CD40 des lymphocytes B induisant la sécrétion des cytokines qui orienteront la réponse immunitaire. Durant cette interaction, le lymphocyte B reçoit du lymphocyte T des signaux nécessaires à sa prolifération et sa maturation, comme l’IL-2 et l’IL-4.

b) Lymphocytes T

Les lymphocytes T achèvent leur développement dans le thymus, ils représentent plus de 80% des lymphocytes circulants et expriment le marqueur CD3 à leur surface. Les lymphocytes T sont composés de deux types de populations caractérisées par leur récepteur spécifique pour l’antigène (TCR pour « T-cell receptor »). Ainsi, on distingue les lymphocytes T αβ (>90% des lymphocytes T) et les lymphocytes T γδ. Les lymphocytes T

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αβ peuvent être sous divisées en deux sous-populations suivant leur expression des protéines membranaires CD4 ou CD8 (Janeway et al., 2009; Kuby et al., 2008).

Lymphocytes T CD4+

Les cellules T CD4+, ou auxiliaires ou « helper » (LTh pour « helper »), reconnaissent un antigène présenté par des molécules du CMH de classe II des CPA. Il s’agit d’antigènes d’origine exogène. Lorsqu'une CPA active une cellule T CD4+ naïve dans un tissu lymphoïde périphérique, la cellule T peut se différencier en cellule auxiliaire effectrice de différents types en fonction des signaux qu’elle reçoit : Th1, Th2, Th9, Th17 ou Tfh (Fevrier et al., 2011; Zhu et al., 2010). Ces sous-classes peuvent être distinguées par les cytokines qu'elles sécrètent et sont présentées dans la Figure 2. Seuls les lymphocytes Th1 et 2 et les Tregs seront détaillés dans cette introduction.

Les cellules Th1, sont en particulier caractérisées par leur sécrétion d’IFNγ et de TNF-α ce qui induit la stimulation des phagocytes conduisant à la destruction des pathogènes capturés. Cela permet également d'activer les cellules T cytotoxiques pour lyser les cellules infectées. Les cellules Th1 stimulent la production d'anticorps de type IgG2, promotteurs d’opsonisation, par les lymphocytes B. Les cellules Th1 participent donc principalement à la protection de l’organisme contre des pathogènes intracellulaires, tels qu’un virus ou une bactérie.

Si le lymphocyte T auxiliaire naïf se différencie en une cellule Th2, il va sécréter les interleukines IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13 et participer à la protection de l’organisme contre les agents étrangers tels qu’une toxine bactérienne. Une cellule Th2 stimule les lymphocytes B pour la production d'anticorps principalement de type IgG1 et IgE qui interviennent dans la réaction allergique.

Ainsi, la différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs en cellules effectrices Th1 ou Th2 influence le type de réponse immunitaire adaptative qui sera générée contre le pathogène. Au sein des cellules T CD4+, on distingue une population particulière de phénotype CD25+ FoxP3+ qui a une fonction régulatrice : les lymphocytes T régulateurs (Tregs). Les Tregs participent à la tolérance immunitaire en régulant la réponse des lymphocytes T effecteurs par leur action immunosuppressive. Ils sont essentiels pour la tolérance aux antigènes du soi. On distingue les Treg naturels (nTregs) d’origine thymique et les Treg induits (iTregs) notamment en périphérie par le TGFβ, l’IL-2 mais aussi l’IL-10.

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Figure 2. La différenciation des lymphocytes T auxiliaires et leur rôle dans la réponse

immunitaire (d’après Février 2011). À la suite de l'activation par un antigène donné, les cytokines sécrétées dans le micro-environnement définissent le type de cellules effectrices induites à partir de cellules T naïves.

Lymphocytes T CD8+

Les lymphocytes CD8+ naïfs sont activés par l’interaction de leur TCR avec le

complexe antigène/CMH de classe I présenté par les CPA (DCs) qui expriment des molécules de costimulation telles que CD80/86. Les lymphocytes T CD8+ se différencient alors en

cellules effectrices cytotoxiques capables de reconnaître l’antigène présenté par les molécules du CMH de classe I exprimées par les cellules infectées ou tumorales. Il s’agit principalement d’antigènes d’origine endogène. Cependant il existe une voie de présentation croisée qui induit la présentation d’antigènes exogènes par les molécules du CMH de classe I.

La cytotoxicité, aboutissant à l’élimination d’une cellule cible, fonction principale des lymphocytes T CD8+ activés, peut faire intervenir deux voies : la voie perforine/granzymes, c’est-à-dire la dégranulation et libération de nombreuses enzymes et cytotoxines, ainsi que la voie Fas/FasL qui par cascade de signalisation conduit à la mort de la cellule cible par apoptose. Outre leur capacité cytolytique, les lymphocytes T cytotoxiques sont capables de

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secréter différents médiateurs de la réponse immunitaire comme l’IL-2, l’IFNγ, le TNF-α ainsi que des chimiokines.

II-B-2. Tolérance centrale et périphérique

En dehors des situations pathologiques, le système immunitaire ne développe pas de réaction mettant en jeu l’intégrité des tissus du soi : c’est ce qu’il est convenu d’appeler la tolérance immunitaire physiologique, définie comme un état de non-réponse à un antigène. La tolérance dépend de l’action concertée de divers mécanismes qui opèrent à différents sites et stades du développement, ce qui définit la tolérance centrale et la tolérance périphérique. Ces mécanismes agissent comme une succession de points de contrôles prévenant des réactions contre les antigènes du soi, tout en évitant la perte d’efficacité du système immunitaire face aux dangers.

Tout sujet sain génère des lymphocytes auto-réactifs dirigés contre divers antigènes du soi. La tolérance centrale a lieu dans l’organe lymphoïde primaire, le thymus, pour les lymphocytes T et dans la moelle osseuse pour les lymphocytes B. En ce qui concerne les lymphocytes T, la tolérance centrale aboutit à la délétion des clones portant des TCR capables de reconnaître avec une forte affinité les auto-antigènes dans le contexte des molécules du CMH de classe I ou de classe II. Concernant les lymphocytes B, leurs BCR ne doit reconnaître aucun antigène présent dans la moelle osseuse et dans le cas contraire, ils meurent par apoptose.

La tolérance périphérique régule les cellules auto-réactives ayant échappé à la tolérance centrale à cause de l’absence de l’auto-antigène spécifique dans le thymus ou d’une trop faible affinité de leur TCR pour l’auto-antigène. La tolérance périphérique peut faire intervenir, entre autres mécanismes, l’induction d’un état d’anergie ou la suppression des lymphocytes T par des Tregs, ou encore des cytokines immunosuppressives telles que l’IL-10.

III. Le cancer face à l’immunité

III-A. Généralités

Paul Ehrlich a été un des premiers à émettre l’idée que le système immunitaire était capable de combattre les tumeurs (Ehrlich 1909).

Dans les années 60, Burnet et Thomas ont émis l'hypothèse que les lymphocytes agissent comme des sentinelles dans la reconnaissance et l'élimination des cellules transformées (Burnet, 1957). Burnet décrit le concept ainsi :

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« It is an evolutionary necessity that there should be some mechanism for eliminating or inactivating such potentially dangerous mutant cells and it is postulated that this mechanism

is of immunological character. »

Dès lors, de nombreuses équipes ont tenté de prouver ce mécanisme par des expériences chez la souris, à savoir comparer l’incidence des tumeurs entre souris immunodéficientes et souris contrôles. Mais les résultats n’étaient pas toujours reproductibles, malgré les diverses méthodes utilisées pour obtenir des souris immunodéficientes (thymectomie, sérums). Durant les années 70, les travaux de Stutman et Rygaard sur les souris nude (modèle murin dépourvu de thymus et donc de lymphocytes T par mutation naturelle) ne montrant aucune différence statistique avec les souris normales, ont mené à un déclin de la théorie d’immuno-surveillance de Thomas et Burnet, sans totalement l’abandonner (Dunn et al., 2002).

Une meilleure connaissance des cellules de l’immunité, ainsi que les progrès en terme de transgénèse chez la souris ont permis une renaissance du concept d’immuno-surveillance dans

les années 90. En effet, les souris Rag-/- (Shinkai et al., 1992), déficientes en lymphocytes B et

T, développent spontanément les tumeurs plus rapidement que les souris contrôles, démontrant le rôle de l’immunité adaptative face au cancer.

De même chez l’homme, on observe une augmentation de la fréquence de cancers chez les personnes immunodéficientes, telles que des patients atteints du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) (Boshoff and Weiss, 2002) ou des patients ayant été transplantés et sous traitement immunosuppresseur (Vajdic et al., 2006). La présence de

lymphocytes T, et notamment de T CD8+, au sein des tumeurs corrèle avec une augmentation

du temps de survie des patients dans le cas du mélanome (Clemente et al., 1996), mais aussi dans le cas des cancers du sein (Rilke et al., 1991), du colon (Galon et al., 2007; Nacopoulou et al., 1981), et de la prostate (Epstein, 1976).

Aujourd’hui, les données obtenues chez la souris et chez l'homme fournissent des preuves solides quant à l'existence et la pertinence physiologique d’une réponse immunitaire contre le cancer, d’où une recherche importante sur les possibilités d’immunothérapie comme traitement du cancer.

III-B. Le cancer : « soi » ou « non soi » ?

Les cellules cancéreuses sont des cellules du « soi » transformées exprimant un nombre important de mutations ou dues à la présence d’un agent infectieux. Certaines molécules de surface sont alors modifiées ou exprimées différemment, et alors qualifiées d’antigènes associés à la tumeur (TAA). Ainsi, le système immunitaire reconnaît ces cellules

(31)

comme du « non-soi ». L'existence de TAA est basée sur la constatation que les tumeurs induites dans des modèles animaux sont souvent rejetées quand elles sont transplantées à des hôtes syngéniques, tandis que les greffes de tissus normaux entre les hôtes syngéniques sont acceptées (Pardoll, 2003). Les TAA peuvent être classés en six catégories : i) les antigènes spécifiques des tumeurs, comme les protéines codées par les gènes MAGE, ii) les antigènes codés par des formes mutées des gènes, par exemple une mutation antigénique de la kinase 4 cycline dépendante a été retrouvée dans certains mélanomes, iii) les antigènes qui ne sont normalement exprimés qu’à certaines étapes de la différenciation ou uniquement par certains types cellulaires tels que TRP1/gp75 et TRP2 exprimés par les mélanocytes, mais pas par les autres types cellulaires, iv) les antigènes qui sont surexprimés dans des tumeurs particulières tel que HER-2/neu dans le cancer du sein, v) les mucines sous glycosylées et enfin vi) les antigènes de virus oncogéniques tels que les oncoprotéines E6 et E7 des papilloma virus humains (Boon and Old, 1997).

D’autre part, la littérature dénombre plusieurs associations entre tumeurs et syndromes paranéoplasiques (auto-immunité) (Franks and Slansky, 2012). Quand une cellule normale devient cancéreuse, elle exprime des antigènes supplémentaires, les antigènes tumoraux, mais aussi les antigènes du soi qu’elle exprime normalement. Les LB auto-réactifs ayant échappé aux mécanismes de tolérance vont alors être activés et produire des auto-anticorps que l’on retrouve dans le sérum des patients. Ainsi, bien que relativement rares, des syndromes paranéoplasiques, maladies résultant de réactions croisées avec des antigènes de la tumeur, peuvent se manifester. Cette appartenance au « soi » des cellules tumorales a pour conséquence la facilité des tumeurs à être tolérées par le système immunitaire et la difficulté de mise au point des immunothérapies. Cependant, aujourd’hui, de nombreuses études décrivent l’existence d’une réponse immunitaire anti-tumorale chez les patients.

III-C. Théorie des 3 E et concept d’« Immuno editing »

Le système immunitaire, par l’action conjointe de ces composantes innées et adaptatives, peut intervenir à plusieurs niveaux pour aider l’organisme à lutter contre le développement de cancer : i) en combattant les virus oncogènes, ii) en éliminant les cellules cancéreuses et iii) en éradiquant les infections, diminuant ainsi le risque de tumorogenèse due à un environnement inflammatoire.

Figure

Tableau 2. Les TLRs humains et murins  TLRs  Localisation
Figure  2.  La  différenciation  des  lymphocytes  T  auxiliaires  et  leur  rôle  dans  la  réponse  immunitaire  (d’après  Février  2011)
Figure 3. Les trois phases de la théorie des 3 E.
Figure 5. Morphologie des CDps en microscopie électronique (Colonna, 2004).
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