Plusieurs tests ont été réalisés afin de trouver la meilleure combinaison possible selon plusieurs critères que sont la configuration de l’appareil, les anticorps couplés disponibles au laboratoire et chez les fournisseurs, la faisabilité des compensations entre les différents canaux utilisés, et la discrimination des populations d’intérêt.
Les marqueurs d’identification des CDps choisis ont été CD45.2 pour sélectionner les cellules hématopoïétiques, ainsi que PDCA1, B220 et CD11c qui caractérisent les CDps. Néanmoins, pour avoir une meilleure discrimination de cette population, nous pouvons exclure les monocytes, granulocytes par le marqueur CD11b et/ou les lymphocytes B par le marqueur CD19. Ainsi, nous pouvons exclure les cellules myéloïdes et/ou éliminer les lymphocytes B qui expriment le marqueur PDCA1, marqueur caractéristique des CDps, lorsqu’ils sont activés.
Les marqueurs d’activation étudiés sont PDC-Trem, CD69, CD80, CD86, et les molécules du CMH de classe I et II (Kb et I-Ab). Les molécules impliquées dans l’interaction des CDs avec les cellules T, choisies pour cette étude phénotypique, sont PDL1, ICOS-L et OX40-L. Enfin, deux marqueurs spécifiques des CDps, Ly6C et SiglecH, ont été étudiés.
a) Premier test
Le 1er test a été réalisé sur les splénocytes d’une souris naïve et d’une souris ayant reçu
du CpG ODN 2216. Nous avons décidé d’utiliser les deux marqueurs d’exclusion (CD11b et CD19) avec des anticorps couplés au même fluorochrome (Tableau 5). J’ai testé plusieurs anticorps d’intérêt pour le phénotypage (Panels 1 à 3), ce qui m’a permis également de révéler les éventuelles difficultés de compensation d’un marquage multicouleur. Pour certains marqueurs, nous ne disposions que d’anticorps biotinylés, ce qui nécessite un second marquage avec de la streptavidine couplée à un fluorochrome. J’ai donc testé plusieurs conjugués pour effectuer ce couplage biotine/streptavidine fluorochrome (Biot- Fluorochrome).
Tableau 5. Panels d’anticorps utilisés pour le 1er test.
A. Fluorochrome PerCP PECy7 PECy5.5 APC PB UV
Marqueur B220 CD11b CD19 CD45.2 PDCA1 CD11c DAPI
B. Panel 1 Fluorochrome FITC Biot-PETR PE
Marqueur CD69 ICOS-L PDCtrem
Panel 2 Fluorochrome FITC Biot-CY
Marqueur I-Ab OX40-L
Panel 3 Fluorochrome FITC Biot-PE
Marqueur Kb PDL1
A. Marqueurs communs aux 3 panels. Les couleurs représentent les lasers correspondants aux
fluorochromes utilisés (bleu, jaune, rouge, violet et UV). B. Panel 1, Panel 2 et Panel 3. Bien que les populations (CDps et CDcs) aient pu être clairement définies, l’analyse de ces premières données a révélé plusieurs difficultés. Tout d’abord, pour une raison alors inconnue (cf. p.61), le signal du marqueur B220 (PerCP) n’a pas été détecté à l’analyse. D’autre part, le signal du PE Texas Red (PETR, panel 1) a dû fortement être compensé, ce qui engendre des pertes importantes de signal des fluorochromes associés au laser jaune.
Enfin, de manière générale les compensations concernant les fluorochromes excités par le laser jaune se sont révélées difficile. J’ai notamment observé que les signaux engendrés par les marquages CD11b et CD19 (PECy7) sont d’intensité différente, ce qui rend difficile l’exclusion de ces deux marqueurs.
En conclusion de ce premier test, il a fallu i) tester à nouveau le panel commun en s’assurant de bien inclure le B220 PerCP, ii) tester le marquage sur des suspensions de cellules tumorales et ganglionnaires et d’autre part iii) exclure le fluorochrome PETR pour les prochains tests.
b) Second et troisième tests
Les résultats des deux tests suivants sont présentés dans le même paragraphe car ils ont été réalisés à seulement quelques jours d’intervalles et l’analyse des données a été faite en parallèle. Afin de libérer le canal PE pour d’autres marqueurs, j’ai choisi d’utiliser la streptavidine couplée au Cascade Yellow (CY) pour les anticorps biotinylés (Tableau 6).
Tableau 6. Panels d’anticorps utilisés pour les 2ème et 3ème tests.
A. Fluorochrome PerCP PECy7 PECy5.5 APC PB UV
Marqueur B220 CD11b CD19 CD45.2 PDCA1 CD11c DAPI
B. Panel 1 Fluorochrome FITC PE Biot-CY
Marqueur CD69 PDCtrem ICOS-L
Panel 2 Fluorochrome FITC PE Biot-CY
Marqueur I-Ab CD80 OX40-L
Panel 3 Fluorochrome FITC PE Biot-CY
Marqueur Kb CD86 PDL1
Panel 4 Fluorochrome FITC APC PE
Marqueur Ly6C SiglecH PDCA1
A. Marqueurs communs aux 4 panels. Les couleurs représentent les lasers correspondants aux
fluorochromes utilisés (bleu, jaune, rouge, violet et UV). B. Panels 1 à 4. Pour le panel 4 l’anticorps PDCA1 PE a été utilisé car l’anticorps SiglecH n’était disponible qu’en APC. Seul le panel 1 a été utilisé sur les échantillons provenant de la souris porteuse d’une tumeur B16- OVA (rate, ganglion drainant et tumeur).
Pour le 2ème test, les 4 panels ont été évalués sur des splénocytes naïfs ou activés in
vivo par le CpG ODN 2216. Concernant le 3ème test, seul le 1er panel a été testé sur les
suspensions cellulaires provenant d’une souris porteuse de tumeur B16-OVA (rate, ganglion drainant la tumeur et tumeur).
Tout d’abord, une absence de signal du marquage B220 PerCP a été à nouveau observée. J’en ai recherché la cause. Cette absence de signal serait due au fait que les fluorochromes PerCP et PECy5.5 sont excités par des longueurs d’onde différentes (laser bleu pour PerCP et jaune pour PECy5.5), mais ont des spectres d’émission quasi superposés. Il a donc été impossible de définir par ce marquage les cellules B220+ (PerCP) au sein de la
population CD45.2+ (PE Cy5.5).
D’autre part, j’ai pu observer que la sélection de la streptavidine couplée au Cascade Yellow n’était pas judicieuse. En effet, la comparaison des moyennes de fluorescence obtenues pour le marqueur PDL1 dans le premier et le second test a mis en évidence que le signal engendré par le Cascade Yellow est nettement plus faible que celui du PE. Ceci
Enfin, le choix d’utiliser le même fluorochrome pour deux marqueurs (CD11b et CD19) ne s’est finalement pas révélé pertinent car les signaux générés par ces deux marquages sont différents. En effet, les difficultés de compensations, déjà observées lors du premier test, se sont accrues notamment sur l’échantillon tumoral. Ainsi, le signal correspondant au CD19 étant plus fort que celui correspondant au CD11b, la compensation du 1er signal engendre un écrasement du signal du 2ème : il en résulte une exclusion des cellules
CD19+ mais sans exclure toutes les cellules CD11b+.
En conclusion de ces tests, il a fallu i) changer de fluorochrome pour les marquages B220 et CD45.2, ii) changer de fluorochrome pour les marquages utilisant la streptavidine, iii) jouer sur l’ensemble des canaux disponibles afin de faciliter les compensations.
c) Quatrième test
Pour ce dernier test, les panels d’anticorps ont été évalués sur des cellules provenant i) d’une rate et d’un ganglion de souris naïve, ii) d’une rate et d’un ganglion d’une souris ayant été injectée avec du CpG ODN 2216, iii) d’une rate, d’un ganglion drainant la tumeur et d’une tumeur de souris porteuse d’une tumeur B16-OVA (Tableau 7).
J’ai choisi d’utiliser le fluorochrome APC AF780 pour l’anticorps CD45.2 et j’ai utilisé le PerCPCy5.5 pour l’anticorps B220 à la place du PerCP. Ces fluorochromes PerCP et PerCPCy5.5, une fois excités, émettent dans le même canal, mais le signal est amplifié par le couplage avec Cy5.5, permettant de faciliter la discrimination des cellules exprimant le marqueur B220.
Concernant le fluorochrome couplé à la streptavidine, j’ai choisi d’utiliser le V500. Ce fluorochrome a des spectres d’excitation et d’émission superposables à ceux du Cascade Yellow. Néanmoins, des expériences réalisées dans le laboratoire ont révélé que le signal du V500 était plus intense.
Enfin, afin de faciliter les compensations, j’ai comparé 2 « panels communs » (panel permettant la définition de la stratégie de marquage) différents (A1 et A2) par le choix du marqueur d’exclusion : CD19 couplé au PECy7 pour l’un et CD11b pour l’autre, en testant le fluorochrome NC650 pour le CD11b.
Tableau 7. Panels d’anticorps utilisés pour le 4ème test.
A1 Fluorochrome PerCPCy5.5 PECy7 APC AF780 APC PB UV
Marqueur B220 CD19 CD45.2 PDCA1 CD11c DAPI
A2 Fluorochrome PerCPCy5.5 APC AF780 APC NC650 PB UV
Marqueur B220 CD45.2 PDCA1 CD11b CD11c DAPI
B1 Fluorochrome FITC PE Biot-V500
Marqueur CD69 PDCtrem ICOS-L
B2 Fluorochrome FITC PE Biot-V500
Marqueur Kb CD86 PDL1
A1 et A2. Panels de marqueurs communs. Les couleurs représentent les lasers correspondants
aux fluorochromes utilisés (bleu, jaune, rouge, violet et UV). B1 et B2. Panel 1 et 2
Quelque soit le panel d’anticorps communs, les populations d’intérêts ont pu être identifiées et le nombre de CDps acquis était le même pour les 2 stratégies. Néanmoins les compensations liées à la 2ème stratégie (A2) nous ont paru plus faciles à effectuer car les
signaux des fluorochromes sélectionnés se chevauchent moins. La stratégie finale choisie est détaillée en Figures 15 et 16.
De plus, le choix de la streptavidine V500 a été validé. En effet, nous avons pu observer que les résultats en terme d’intensité de fluorescence obtenus pour PDL1 sont comparables à ceux obtenus durant le 1er test avec la streptavidine PE.