Conclusion et perspectives

Au cours de ce travail, nous avons montré que l’utilisation combinée de la spectrométrie de masse FT-ICR et du clonage moléculaire constitue un outil très efficace pour la caractérisation de nouvelles molécules bioactives directement dans une matrice aussi complexe qu’un venin brut, et ce, sans séparation chromatographique préalable. Les performances de la spectrométrie de masse FT-ICR en terme de précision sur la mesure de masse et haute résolution sont extrêmement utiles pour établir des cartographies massiques et comparer les masses mesurées à celles déduites du clonage ou encore pour le séquençage de

Notre étude a révélé la présence de 22 nouvelles isoformes de sarafotoxines dont les chaînes en acides aminés varient de 15 à 30 acides aminés (Tableau 8). Ces toxines peuvent être regroupées en trois familles dont les espèces les plus représentées au sein du venin sont les formes composées de 25 acides aminés. Ces sarafotoxines sont plus longues que les endothélines (21 acides aminés) mais aussi que les autres sarafotoxines décrites lors des études sur A. engaddensis9 (21 acides aminés) et A. microlepidota microlepidota3 (24 acides aminés). Certains aminés qui apparaissaient conservés entre les endothélines et les sarafotoxines connues se sont révélés variables apportant une nouvelle diversification des séquences en acides aminés. Les tests biologiques sur ces nouvelles SRTXs n’ayant pas encore été réalisés, il est difficile d’évaluer l’influence de ces nouvelles modifications sur l’activité biologique. ET-1 C S C S S L M D K E C V Y F C H L D I I W ET-131 C S C S S L M D K E C V Y F C H L D I I W V N T P E H V V P Y ET-2 C S C S S W M D K E C V Y F C H L D I I W ET-231 C S C S S W M D K E C V Y F C H L D I I W V N T P E Q T A P Y ET-3 C T C F T Y K D K E C V Y Y C H L D I I W ET-331 C T C F T Y K D K E C V Y Y C H L D I I W I N T P E Q T V P Y Rongeurs VIC C S C N S W L D K E C V Y F C H L D I I W SRTX-a C S C K D M T D K E C L N F C H Q D V I W SRTX-b C S C K D M T D K E C L Y F C H Q D V I W SRTX-c C T C N D M T D E E C L N F C H Q D V I W A. bibroni Btx C S C A D M T D K E C L Y F C H Q D V I W SRTX-m16 C S C N D I N D K E C M Y F C H SRTX-m24 C S C N D I N D K E C M Y F C H Q D V I W D E P SRTX-m124 C S C N D M N D K E C M Y F C H Q D V I W D E P SRTX-m211 C S C N D I N D K E C SRTX-m218 C S C N D I N D K E C M Y F C H Q D SRTX-m224 C S C N D I N D K E C M Y F C H Q D I I W D E P SRTX-m324 C S C N D M N D K E C V Y F C H L D I I W D E P SRTX-m424 C S C N N M S D K E C L N F C N L D I I W E N V SRTX-m524 C S C N D M N D K E C V Y F C H Q D I I W D E P SRTX-i115 C S C T D M S D L E C M N F C SRTX-i118 C S C T D M S D L E C M N F C H K D SRTX-i119 C S C T D M S D L E C M N F C H K D V SRTX-i120 C S C T D M S D L E C M N F C H K D V I SRTX-i121 C S C T D M S D L E C M N F C H K D V I W SRTX-i123 C S C T D M S D L E C M N F C H K D V I W I N SRTX-i125 C S C T D M S D L E C M N F C H K D V I W I N R N SRTX-i128 C S C T D M S D L E C M N F C H K D V I W I N R N R K P SRTX-i130 C S C T D M S D L E C M N F C H K D V I W I N R N R K P S P SRTX-i217 C S C A D M S D L E C M N F C R L SRTX-i218 C S C A D M S D L E C M N F C R L D SRTX-i220 C S C A D M S D L E C M N F C R L D V M SRTX-i223 C S C A D M S D L E C M N F C R L D V M W V N SRTX-i225 C S C A D M S D L E C M N F C R L D V M W V N R N SRTX-i230 C S C A D M S D L E C M N F C R L D V M W V N R N R K P S P SRTX-i325 C S C T D M S D L E C M N F C H K D V I W V N SRTX-i326 C S C T D M S D L E C M N F C H K D V I W V N R N C C D E C C W T L R K M R N R K P S P

Acide aminés totalement conservés Nouvelle diversité apportée

E N D O T H E L IN E S S A R A F O T O X IN E S

Alignements des séquences des endothélines avec celles de différentes sarafotoxines

A. irregularis A. engaddensis

A. microlepidota microlepidota

Mammifères

Tableau 8 : Alignement des séquences des sarafotoxines retrouvées dans le venin d’A. irregularis avec différentes séquences d’endothélines et de sarafotoxines d’autres Atractaspidae

Sept acides aminés sont conservés entre les trois nouvelles familles SRTX-i1, -i2 et –i3 : les quatre cystéines, qui interviennent de manière importante dans la structuration de tous les peptides, mais aussi des deux acides aspartiques (+8) et glutamique (+10) ainsi que le

tryptophane +21. On peut donc supposer que ces sept acides aminés, également conservés dans les séquences des endothélines, ont un rôle majeur pour l’activité des peptides vasoconstricteurs. Si les cystéines, impliquées dans deux ponts disulfures, assurent la structure compacte de ces toxines, les autres acides aminés pouvant jouer un rôle dans la liaison de ces toxines sur les récepteurs ETA et ETB. Ces hypothèses pourraient être vérifiées

par des expériences de mutations successives des acides aminés conservés suivies de tests de liaisons aux récepteurs cibles.

Les expériences de RMN montrent que les variations observées sur ces nouvelles toxines (longueur de chaîne peptidique, nouveaux acides aminés…) ne modifient pas clairement leur structure tridimensionnelle qui reste très voisine de celles des premières sarafotoxines découvertes et des endothélines.

D’une manière inattendue, les précurseurs codant pour les sarafotoxines des familles SRTX-i1 et SRTX-i2 ont montré une organisation différente de celle qui avait été rencontrée lors des deux précédentes études. Ces résultats représentent la première observation, au sein de la même famille, de précurseurs présentent une organisation différente codant pour des toxines isoformes.

Les perspectives de ce travail sont de déterminer précisément l’activité biologique de ces nouvelles sarafotoxines et notamment de déterminer si les récepteurs ciblés sont les mêmes que ceux des autres sarafotoxines. Les premiers résultats obtenus suggèrent que les sarafotoxines longues (24 acides aminés) lient un site différent du récepteur des sarafotoxines à 21 acides aminés ou un nouveau récepteur. Cette question reste aujourd’hui ouverte. Malheureusement, peu d’équipes travaillent encore sur les récepteurs aux endothélines (notamment l’équipe israélienne qui a fait les premiers tests n’existe plus), ce qui ne facilité pas la suite de ce travail.

Références bibliographiques

1 _{Kloog Y., Sokolovsky M., Similarities in mode and sites of action of sarafotoxins and endothelins, 1989,}

Trends Pharmacol. Sci., 10, 212-214.

2 _{Bdolah, A., Wolfberg Z., Kochva E., Snake Toxins-Sarafotoxins, a New Group of Cardiotoxic Peptides from}

the Venom of Atractaspis, 1991, In: Harvey, A.L., (Ed), Pergamon Press, New York, p415.

3_{Hayashi, M.A.F., Ligny-Lemaire C., Wollberg Z., Wery M., Galat A., Ogawa T., Muller B.H., Lamthanh H.,}

Doljansky Y., Bdolah A., Stöcklin R., Ducancel F., Long-sarafotoxins: characterization of a new family of endothelin-like peptides, 2004, Peptides, 25, 1243-1251

4 _{Deufel A., Cundall D., Feeding in Atractaspis (Serpentes : Atractaspididae) : a study in conflicting functional}

contraints, 2003, Zoology, 106, 43-61.

5 _{Kochva E., Viljoen C.C., Botes D.P., A new type of toxin in the venom of the genus Atractaspis}

(Atractaspididae), 1982, Toxicon, 20, 581-592.

6 _{Takasaki C, Tamiya N., Bdolah A., Wollberg Z., Kochva E., Sarafotoxins S6, several isotoxins from}

Atractaspis engaddensis (burrowing asp) venom that affect the heart, 1988, Toxicon, 26, 543-548.

7 _{Kloog Y., Ambar I., Sokolovsky M., Kochva E., Wollberg Z., Bdolah A., Sarafotoxin, a novel vasoconstrictor}

peptide: phosphoinoditide hydrolysis in rat heart and brain, 1988, Science, 242, 268-270.

8 _{Becker A., Dowdle E.B., Hechler U., Kauser K., Donner P., Schleuning W.D., Bibrotoxin, a novel member of}

the endothelin/sarafotoxin peptide family from the venom of the burrowing asp Atractaspis bibroni., 1993, FEBS

Lett., 315, 100-103.

9_{Ducancel F., Matre V., Dupont C., Lajeunesse E., Wollberg Z., Bdolah A., Kochva E. Boulain J.C., Menez A.,}

Cloning and sequence analysis of cDNAs encoding precursors of sarafotoxins, 1993, J. Biol. Chem. ,268, 3052- 3055.

10 _{Kochva E., Bdolah A., Wollberg Z., Sarafotoxins and endothélines: evolution, structure and function, 1993,}

Toxicon, 31, 541-568.

11 _{Yanagisawa M., Kurihara H, Kimura S, Tomobe Y, Kobayashi M., Yazaki Y., Goto K, Masaki T, A novel}

potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells, 1988, Nature, 332, 411-415.

12 _{Bloch K.D., Hong C.C., Eddy T.B., Shows T.B. and Quaternous T., cDNA cloning and chromosomal}

assignment of the endothelin 2 gene: vasoactive intestinal contractor in rat endothelin 2, 1991, Genomics, 10, 236-242.

13 _{Kishi, F., Minami.K., Okishima N., Murakami M., Mori S., Yano M., Niwa Y., Nakaya Y., Kido H., Novel}

31-amino-acid-lengh endothelins cause constriction of vascular smooth muscle, 1997, Bochem. Biophys. Res.

Com., 248,387-390.

14 _{D’Orléans-Juste P., Plante M., Honoré J.C., Carrier E., Labonté J., Synthesis and degradation of endothelin-1,}

2003, Can. J. Physiol. Pharmacol., 81, 503-510.

15 _{Waller D., Cudney R., Wolff M., Day J., Greenwood A., Larson S., Pherson A., Crystallization and}

preliminary X-ray analysis of human endothelin, 1992, Acta Cryst., 48, 239-240.

16 _{Andersen N. H., Chen C., Marschner T.M., Krystek S.R., Bassolino D.A., Conformational isomerism of}

17 _{Tomoaki H., Kobayashi Y., Nishimura S., Ohkubo T., Kyogoku Y., Nakajima K., Solution conformation of}

endothelin determined by means of 1H-NMR spectroscopy and distance geometry calculations, 1991, Prot. Eng., 4, 509-518.

18 _{Atkins A.R., Martin R.C., Smith R., 1H-NMR studies of sarafotoxine SRTX-b, a non selective endothelin}

receptor agonist, and IRL 1620, an ETB receptor specific agaonist, 1995, Biochem., 34, 2026-2033.

19 _{Van Heijne G., A new method for predicting signal sequence cleavage sites, 1986, Nucleic Acids Res., 14}

(11), 4683-4690.

20 _{Gubler U., Seeburg P., Hoffman B. J., Gage P.L., Udenfriend S., Molecular cloning establishes proenkephalin}

as precursor of enkephalin-containing peptides, 1982, Nature, 295, 206-208.

21 _{Opgenorth T.J., Wu-Womg J.R., Shiosaki K., 1992, Endothelin-converting enzymes, FASEP J., 6, 2653-2659.} 22 _{Liu L.F., Chang C.C., Liau, M.Y., Kuo, K.W., Genetic characterization of the mRNAs encoding a-}

bungarotoxin isoforms and RNA editing in Bungarus multicinctus gland cells, Nucleic Acids Res., 1998, 26, 5624-5629.