3.3 Concepts avancés de recherche d’information
3.3.6 Conclusion
Para a quantificação de FLU sódica na forma farmacêutica cápsulas, foram realizados testes preliminares para padronizar as condições a serem utilizadas verificando- se os parâmetros como micro-organismo, meio de cultura, solução diluente, concentrações do inóculo e do fármaco (Tabela 5.1).
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Tabela 5.1. Parâmetros testados para avaliação de potência de flucloxacilina sódica em
cápsulas pelo método de difusão em ágar
Parâmetros Descrição
Micro-organismo
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 IAL 2150 Staphylococcus aureus ATCC 25923
Micrococcus luteus ATCC 9341 IAL 636
Meios de cultura Meio nº 1 para antibióticos para camada base e semeada Meio nº 11 de Grove-Randall para camada base e semeada
Solução diluente solução tampão fosfato de potássio pH 6,0 solução tampão fosfato de potássio pH 8,0 água
Concentração das soluções
1,0; 4,0; 16 μg/mL; 2,0; 4,0; 8,0 μg/mL; 1,0; 2,0; 4,0 μg/mL; 8,0; 16,0; 32,0 μg/mL; 5,0; 10,0; 20,0 μg/mL; 1,5; 3,0; 6,0 μg/mL; 1,0; 3,0; 9,0 μg/mL Concentração do inóculo 0,5; 1,0; 1,5; 2,0% 5.1.3. Execução do ensaio
De acordo com os resultados obtidos com os diferentes micro-organismos e meios de cultura, foram estabelecidos os parâmetros para realização do doseamento microbiológico (Tabela 5.2). A validação do ensaio foi realizada de acordo com a metodologia descrita para outras penicilinas, em que se emprega a técnica 3 x 3, ou seja, três concentrações de solução padrão e três concentrações de solução amostra (FB 5, 2010) e com a literatura (AOAC, 2002; ICH, 2005, SALGADO et al., 2006; TOZO, SALGADO, 2007; LOPES, SALGADO, 2010; FB 5, 2010; CAZEDEY, SALGADO, 2011).
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Tabela 5.2. Parâmetros estabelecidos para determinação de flucloxacilina sódica em
cápsulas pelo método de difusão em ágar
Parâmetros Descrição Micro-organismo Staphylococcus aureus ATCC 25923
Meio de cultura Meio nº 1 para antibióticos para camada base (5 mL) e semeada (20 mL)
Solução diluente solução tampão fosfato de potássio pH 6,0
Concentração das soluções 1,5; 3,0; 6,0 μg/mL Concentração do inóculo 1,0% Temperatura de incubação 35 ± 1 °C
Tempo de incubação 18 horas
5.1.4. Material
Além dos materiais estabelecidos, descritos na Tabela 5.2, foram utilizados FLU- SQR e FLU-cápsula, descritos nas seções 4.1.2 e 4.1.3, respectivamente.
Para a incubação dos micro-organismos foi utilizada estufa para cultura bacteriológica ECB 1.2 digital, Odontobrás® (Ribeirão Preto, Brasil). Para padronização dos
micro-organismos foi utilizado espectrofotômetro Beckman® modelo DU 530. Para as leituras
dos halos de inibição, utilizou-se paquímetro digital Mitutoyo® (Japão).
Foi utilizado o meio de cultura ágar caseína-soja (Casoy) (Acumedia®, Lansing, EUA)
para manutenção da cepa do micro-organismo, caldo Brain Hearth Infusion (BHI) (Acumedia®, Lansing, EUA) para preparo e padronização do inóculo, meio nº 1 para
antibióticos (Difco®, Sparks, EUA) como camada base e semeada.
Para preparo das soluções tampão fosfato de potássio pH 6,0 e 8,0 foram utilizados fosfato de potássio dibásico (Vetec®, Rocha, Brasil) e monobásico (Vetec®, Rocha, Brasil).
Foram empregadas placas de Petri com 20 mm de altura x 100 mm de diâmetro, e nas tampas foi colocado papel de filtro para impedir que gotículas de condensação invalidassem ou dificultassem a leitura dos halos de inibição e templates de aço inoxidável. Estes materiais e vidraria não volumétrica foram esterilizados em estufa Nova Ética®
400/5ND São Paulo, Brasil) a 180 °C por 1 hora. A água, obtida por sistema de purificação de água Milli-Q® (Malsheim, França), solução tampão fosfato e ponteiras foram esterilizadas
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5.1.4.1. Preparo da solução de flucloxacilina sódica SQR
Foram pesados analiticamente 10 mg de FLU-SQR e transferidos para balão volumétrico de 100 mL e o volume foi completado com água estéril, obtendo solução com concentração de 100,0 μg/mL. Em seguida foram transferidas alíquotas de 150, 300 e 600 μL para balões voluméticos de 10 mL e o volume foi completado com solução tampão fosfato de potássio pH 6,0, obtendo-se soluções com concentrações finais de 1,5; 3,0 e 6,0 μg/mL, codificadas como P1, P2 e P3, respectivamente.
5.1.4.2. Preparo da solução de flucloxacilina sódica em cápsulas
A partir do pool obtido das cápsulas de FLU sódica, foram pesados o equivalente a 10,0 mg de FLU sódica e seguiu-se o mesmo procedimento descrito na seção 5.1.4.1, obtendo-se soluções com concentrações finais de 1,5; 3,0 e 6,0 μg/mL, codificadas como A1,
A2 e A3, respectivamente.
5.1.4.3. Preparo da solução placebo
A solução placebo foi preparada a partir do único excipiente presente nas amostras de cápsulas, estearato de magnésio. Foram transferidos 10 mg de estearato de magnésio para balão volumétrico de 100 mL e o volume foi completado com água, obtendo uma solução com concentração de 100 μg/mL. Em seguida foram transferidas alíquotas de 150, 300 e 600 μL para balões voluméticos de 10 mL e o volume foi completado com solução tampão fosfato pH 6,0, obtendo soluções com concentrações finais de 1,5; 3,0 e 6,0 μg/mL, respectivamente.
5.1.4.4. Preparo do meio de cultura
Os meios de cultura foram preparados conforme indicado pelos fabricantes em seus respectivos rótulos, sendo dissolvidos em água sob aquecimento e esterilizados em autoclave (121 °C, 1 atm) por 15 minutos.
5.1.4.5. Preparo do inóculo
O micro-organismo Staphylococcus aureus ATCC 25923, mantido em ágar caseína- soja inclinado em tubo de ensaio, foi repicado para caldo BHI e incubado por 24 horas a 35 ± 1 °C. A padronização do inóculo foi realizada em espectrofotômetro a 580 nm com transmitância de 25 ± 2%, diluído com o mesmo caldo. Após a padronização, o inóculo foi utilizado a 1% (v/v) em meio ágar nº 1 para antibióticos, mantido em banho aquecido a 46 ± 1 °C (FB 5, 2010).
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5.1.5. Ensaio
A camada base de 20,0 mL de meio ágar nº 1 para antibióticos foi adicionada às placas de Petri. Após sua solidificação, foram adicionados 5,0 mL de meio ágar nº 1 para antibióticos com inóculo a 1% (v/v), com auxílio de pipetador automático. Após a solidificação desta camada, foi colocado o template em cada placa, cujos orifícios foram preenchidos com 200,0 μL das soluções descritas nas seções 5.1.4.1 e 5.1.4.2, respectivamente e como apresentado na Figura 5.1. As placas foram incubadas em estufa a 35 ± 1 °C e após 18 horas foram realizadas as medidas dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento bacteriano, com auxílio de paquímetro digital. Todo o procedimento foi realizado em capela de fluxo laminar. Foram preparadas 24 placas para o doseamento de FLU em cápsulas sendo que, em cada ensaio foram utilizadas 6 placas e os resultados foram analisados estatisticamente.
Figura 5.1. Esquema do delineamento 3 x 3 demonstrando a disposição das soluções padrão (P) e
amostra (A) na placa de Petri, em que P1 (1,5 μg/mL), P2 (3,0 μg/mL), P3 (6,0 μg/mL) e A1 (1,5
μg/mL), A2 (3,0 μg/mL), A3 (6,0 μg/mL).
5.1.5.1. Obtenção da curva analítica
Para a construção da curva analítica foram utilizados três pontos como preconizado pela Farmacopeia Brasileira (FB 5, 2010) para delineamento 3 x 3 e a disposição das soluções padrão (P) e amostra (A) é apresentado na Figura 5.1. Foram feitas quatro curvas analíticas em quatro dias consecutivos e, cada curva continha seis réplicas de cada concentração. P1 P2 P3 A1 A2 A3
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5.1.5.2. Cálculo da potência de flucloxacilina sódica em cápsulas
A potência de FLU sódica em cápsulas foi determinada conforme equação de Hewitt (2004), (Equação 1). A Equação 1 utiliza as médias dos halos de inibição obtidos com as três doses de FLU-SQR e FLU-amostra, nas seis placas analisadas em cada ensaio.
( )%
=
Anti
log
M
×100
Potência
Em que:M =
F
b
;b =E
I
; I =logR )] ( ) [( 3 1 3 2 1 3 2 1 A A P P P A F = + + − + + )] ( ) [( 4 1 1 1 3 3 P A P A E = + − +5.1.6. Validação do método microbiológico