b Complexation des composés modèles

Les ligands3, 4et5ont été complexés avec du99mTc pour servir de composés modèles dans la validation du test d’extraction de tumeur. La métallation a également été réalisée avec du rhénium afin de caractériser les complexes, mais aussi pour réaliser des tests de compétition in vivo avec les traceurs correspondants radiomarqués au 99mTc. Enfin, la complexation a été réalisée avec du 99gTc afin d’effectuer une identification par LC-MS et de confirmer la formation des complexes de 99mTc par une corrélation des temps de rétention en HPLC (détection UV et γ) entre complexes de99gTc et 99mTc.

Le marquage au 99mTc de 3 a été adapté du protocole décrit [Haubner 04a]. La com-plexation du motif N3S a été réalisée par transchélation d’un intermédiaire tartrate, ob-tenu par réduction du pertechnétate à l’aide de SnCl2 en présence de tartrate de sodium, en 15 min à 90°C, sur 0,01 µmol de ligand. Un essai de marquage, réalisé à l’aide de l’intermédiaire gluconate (30 min à 50°C) a donné un résultat identique. La métallation par co-marquage au 99m/99gTc, par transchélation des intermédiaires gluconate correspon-dants, a permis d’identifier le complexe99gTc-3par LC-MS (tR= 15,5 min, m/z = 1184,3 [M + H+]) et de confirmer la formation du complexe99mTc-3par comparaison des temps de rétention en HPLC (tR = 15,5 min) (Fig. II.11). Les trois pics du massif isotopique correspondent à la présence des soufres 32 et 34. La complexation au rhénium a été ob-tenue par un intermédiaire tartrate à partir de perrhénate de sodium dans les conditions décrites par Haubner et le complexe Re-3 a été purifié par HPLC.

Fig. II.11 – Chromatogrammes HPLC de 99gTc-3 (détection UV - 254 nm, A) et de

99mTc-3 (détection γ, B). HPLC Varian, colonne C18 analytique, gradient 0-100% B en 30 min. Spectre de masse de 99gTc-3 (C).

La complexation du99mTc par le ligand4 a été effectuée par transchélation de l’inter-médiaire gluconate pour donner 99mTc-4. Une étape préalable de réduction du disulfure du motif NS2 a été réalisée juste avant la métallation à l’aide de tributylphosphine 1% dans de l’éthanol dégazé à l’argon. Le milieu réactionnel a ensuite été dilué dans du tam-pon PBS pour atteindre une concentration optimale de 500 µM et disposer ainsi d’une solution au pH physiologique directement injectable in vivo. Les meilleurs résultats en termes de pureté ont été obtenus en incubant un mélange 99mTc-gluconate/ligand (500

µM) 1/1 (v/v) pendant 30 min à 90°C. Ces conditions sont issues d’une optimisation portant sur la concentration en ligand dans le mélange de complexation, sur la tempéra-ture et sur le temps d’incubation. Des essais ont également été réalisés pour augmenter le volume de 99mTcO-gluconate à introduire tout en conservant la même concentration finale de complexant. Nous souhaitions en effet pourvoir disposer d’une activité maximale dans un volume minimum, puisque les injections intraveineuses dans la queue des souris ne peuvent dépasser un volume de 100 µL. Nous avons ainsi pu atteindre des activités de 13 à 18 MBq/100 µL pour les tests in vivo. Un essai de transchélation à partir de l’intermédiaire tartrate a été réalisé pour comparaison avec la méthode de marquage dé-crite précédemment [Haubner 04a]. Cependant, le complexe n’a pas été obtenu dans ces conditions. Comme précédemment, un co-marquage au99m/99gTc a permis de confirmer la formation des complexes de technétium99mTc-4(HPLC : tR= 17,6 min) et99gTc-4(tR= 17,5 min, m/z = 1124,1 [M + H+]) (Fig. II.12). Là encore, le massif isotopique observé est caractéristique d’une molécule à trois atomes de soufre. La complexation au rhénium, réa-lisée avec le précurseur tétrabutylammonium tétrachlorooxorhénate, a conduit au produit

Re-4 qui a été purifié par HPLC.

Fig. II.12 – Chromatogrammes HPLC de 99gTc-4 (détection UV - 254 nm, A) et de

99mTc-4 (détection γ, B). HPLC Varian, colonne C18 analytique, gradient 0-100% B en 30 min. Spectre de masse de 99gTc-4 (C).

L’assemblage, par coordination du cœur oxotechnétium, du ligand(NS2)-c(RGDfK) 5avec la cystéine a été problématique et a nécessité une importante mise au point qui reste imparfaite. Le ligand5a été préalablement réduit avec une solution de tributylphosphine. Dès les premiers essais de marquage, nous avons obtenu plusieurs pics en radio-HPLC que nous avons pu identifier comme correspondant d’une part au complexe bimoléculaire attendu entre la cystéine et le ligand 5 et d’autre part à la complexation exclusive de la cystéine ou du ligand NS2 (Fig. II.13 B et II.14). L’identification du complexe attendu a été possible par comparaison des temps de rétention HPLC entre les complexes 99mTc-5

(HPLC : tR = 18,5 min) et 99gTc-5, ce dernier ayant été identifié par LC-MS (tR = 18,3 min, m/z = 1014,0 [M + H+]) (Fig. II.13). Le pic à 14,8 min a été identifié comme un complexe de cystéine, Cys-99mTcO-Cys, aussi bien en99gTc (Fig. II.13) qu’en99mTc (Fig. II.14). Le pic à 3,9 min correspond à du technétium libre réduit (Fig. II.14).

Fig. II.13 – Chromatogrammes HPLC de 99gTc-5 (détection UV - 254 nm, A) et de

99mTc-5 (détection γ, B). HPLC Varian, colonne C18 analytique, gradient 0-100% B en 30 min. Spectres de masse de 99gTc-5 (C) et de Cys-99gTcO-Cys avec sa structure supposée (D).

Des essais de transchélation de l’intermédiaire tartrate se sont avérés négatifs alors que le complexe a pu être mis en évidence par transchélation du99mTcO-gluconate. Nous avons montré que l’ajout du 99mTcO-gluconate dans la solution de 5 réduit, suivi de la cystéine était préférable à l’ajout de l’intermédiaire gluconate sur un mélange des deux entités complexantes. Ce résultat reflète probablement la différence de cinétique de complexation qui serait curieusement plus rapide pour la cystéine que pour le ligand5. On peut supposer que l’addition de 99mTcO-gluconate sur5 réduit permet la formation d’un premier intermédiaire, l’ajout de cystéine permettant d’obtenir le complexe attendu (Fig. II.15 A). Lorsque que la cystéine est présente dès le départ, la transchélation conduirait préférentiellement au dimère de cystéine (Fig. II.15 B).

Fig.II.14 –Chromatogrammes HPLC des mélanges obtenus après incubation de 99m TcO-gluconate avec de la cystéine ou du ligand5réduit. HPLC Varian, colonne C18 analytique, détection γ, gradient 0-100% B en 30 min.

Fig. II.15 – Hypothèses de transchélation pour rendre compte de la formation du dimère de cystéine lors du marquage au 99mTc.

L’optimisation du marquage au 99mTc a ensuite porté sur la détermination de la concentration optimale en ligands dans le mélange de complexation ainsi que sur la tempé-rature et le temps d’incubation. La proportion la plus importante de complexe attendu par rapport aux produits secondaires a été obtenue avec une concentration finale de chacun des ligands de 250 µM et une incubation de 15 min à 90°C.